張夢瑤,楊 峰,劉開東,劉積鳳,柳 楠,賀建寧

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東 青島 266109;2.青島畜牧獸醫(yī)研究所,山東 青島 266121;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

在早些年我國就培育出細毛羊品種敖漢細毛羊,主要分布在東北地區(qū)、內(nèi)蒙古地區(qū)。其羊毛的品質(zhì)相比于其他羊的毛品質(zhì)要高,是我國最具有代表性的細毛羊之一[1]。細毛羊毛囊是皮膚的重要附屬結(jié)構(gòu),是產(chǎn)生被毛的組織,它的性狀和組織結(jié)構(gòu)決定著被毛品質(zhì)和羊毛產(chǎn)量。毛囊發(fā)育形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及發(fā)育規(guī)律,對羊毛性狀有重要影響,是探究毛囊生長發(fā)育調(diào)控機制的基礎(chǔ)。毛囊具有自我更新和周期性生長的特點,其周期性變化決定被毛的生長與脫落,并受多種因子調(diào)控[2]。因此探究毛囊的生長發(fā)育調(diào)控的基因已顯得非常重要。

Hox家族是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,目前共有39個[3],其對毛囊細胞增殖與分化有重要作用[4-5]。對人和小鼠的研究發(fā)現(xiàn),幾乎所有的Hox家族基因均在皮膚和毛囊中表達[6]。Hoxa5參與皮膚細胞增殖、分化與凋亡的調(diào)控[7],是毛囊退行期調(diào)控的關(guān)鍵因子,在誘導細胞周期阻滯和終端分化中發(fā)揮作用[8]。張燕軍等[9]研究發(fā)現(xiàn),在絨山羊胚胎115 d和成年羊10月時,于初級毛囊內(nèi)根鞘和毛干皮質(zhì)層中檢測到Hoxa4和Hoxa5基因。Hoxa7在人和鼠的毛囊內(nèi)、外根鞘中表達[10]。張燕軍等[11]研究表明,Hoxa5基因在胚胎不同時期及成年羊皮膚毛囊中均有表達,推斷該基因?qū)γ壹毎鲋称鹱饔?。Hoxa5在控制毛生長發(fā)育中有重要作用,當過表達時,小鼠會表現(xiàn)出毛生長的缺陷[12]。吳江鴻[13]發(fā)現(xiàn),Hoxa5基因的表達量與絨山羊胎兒皮膚厚度變化趨勢一致,成年后則與次級毛囊周期呈顯著相關(guān),且在體外培養(yǎng)的毛囊中Hoxa5基因表達導致角質(zhì)化細胞死亡。

目前,對Hoxa5基因與家畜皮膚毛囊關(guān)系的研究主要集中在絨山羊和小鼠身上,主要通過熒光定量PCR在分子水平上有過相應(yīng)的研究,還有一些是與骨的調(diào)節(jié),繁殖等與皮膚毛囊無關(guān)的研究,尚未發(fā)現(xiàn)Hoxa5基因通過在細胞水平上來研究細毛羊毛囊發(fā)育方面的相關(guān)報道。因而本研究通過對其質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成纖維細胞來進行Hoxa5基因表達的分析。結(jié)果表明,質(zhì)粒構(gòu)建成功且Hoxa5基因轉(zhuǎn)染細胞后過表達?？蔀榇嘶蛟趥€體層次上的研究提供了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選取健康40日齡的胎羊(由青島畜牧獸醫(yī)研究所奧特種羊場提供)。

1.2 主要試驗試劑及儀器 pGM-T載體、pcDNA3.1質(zhì)粒、EcoR1、Nde1限制性內(nèi)切酶、DH5ɑ感受態(tài)細胞、DMEM、標準胎牛血清等,均購自青島賽尚科貿(mào)有限公司。BB5060UV型賀氏二氧化碳培養(yǎng)箱,購自德國Eppendorf公司;Leica DMIRB型倒置顯微鏡、Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng),均購自Bio-Rad公司。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

(1)引物設(shè)計：利用RNA提取試劑盒對組織進行RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。選取綿羊Hoxa5基因組(GenBank登錄號為NM-001009431.1)CDS區(qū) ,在CDS區(qū)外側(cè)通過Primer5.0軟件設(shè)計引物并在上下游引物 5′端加入保護堿基和 EcoR1、Nde1酶切位點。

上 游 引 物：5′-CCGGAATTCATGAGCTCTTATTTTGTAAAC-3′;

下游引物：5′-GGAATTCCATATGTAAACGCTCAAATACTCAGG-3′;并進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增體系為：DNA模板1 μL,上下游引物各 1 μL,Green Mix 17 μL。

(2)TA克?。簩CR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳回收連接。pGM-T載體連接體系：T4 DNA連接酶2 μL;T4 DNA 連接酶 Buffer 1 μL;pGM-T 載體2 μL;DNA 片段5 μL;置于16 ℃金屬浴中3 h,然后4℃過夜。轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞、涂布在AMP抗生素的平板上,37℃、培養(yǎng)12 h,挑單菌搖菌并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序[14]。

(3)Hoxa5基因與pcDNA3.1質(zhì)粒重組：對TA克隆載體及pcDNA3.1質(zhì)粒同時進行EcoR1、Nde1雙酶切,酶切體系為：EcoR1 1 μL;Nde1 1 μL;pGM-THoxa5 和 pcDNA3.1 5 μL;Buffer 1 μL;ddH2O 42 μL;37℃ 2 h,對 Hoxa5基因和 pcDNA3.1進行膠回收。連接體系：Hoxa5片段5 μL;pcDNA3.1 3 μL;T4 DNA 連接酶 1 μL;T4 DNA 連接酶 Buffer 1 μL;22℃金屬浴中反應(yīng)2 h,16℃ 3 h后轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞,挑單菌搖菌,進行菌液PCR鑒定陽性率,將陽性組送往公司測序,并通過質(zhì)粒提取試劑盒獲得陽性質(zhì)粒[14]。

1.4 敖漢細毛羊成纖維細胞培養(yǎng) 取40日齡胎羊用75%酒精和PBS清洗。去除頭部和四肢剩余軀干用眼科剪將其剪成1.0～2.0 mm3大小的組織塊,滴加37.0℃預(yù)熱的胎牛血清,加入培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱(37℃,5.0%CO2)。24 h進行換液,每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況,待細胞密度達到90%左右進行傳代。傳代時加入0.25%胰蛋白酶1.0 mL,37.0℃消化5 min,當細胞變圓,加入3倍體積的DMEM終止消化,按相應(yīng)比例進行傳代[14]。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染 待細胞傳代后2～3天用Lipofectamine2000進行瞬時轉(zhuǎn)染。孵育體系：試驗組：脂質(zhì)體 20 μL,DMEM(不含雙抗)480 μL;對照組：脂質(zhì)體 20 μL,DMEM(不含雙抗)480 μL;混勻,靜置5 min。 轉(zhuǎn)染體系：試驗組：質(zhì)粒 40 μL,DMEM 460 μL;對照組：DMEM 500 μL;靜置 20 min,各加入4 mL DMEM,37℃培養(yǎng)6 h后換液,培養(yǎng)36 h。

1.6 轉(zhuǎn)染細胞的定量檢測 對轉(zhuǎn)染成功的細胞進行培養(yǎng),待細胞密度達到90%時加入3 mL的TR-IZol(Roche)裂解細胞并提取RNA。完成后利用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)敖漢細毛羊Hoxa5基因的CDS區(qū)和綿羊GAPDH的CDS區(qū),使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計Hoxa5和GAPDH基因的引物序列,見表1。

實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3次重復(fù),采用Ct(2-ΔΔCt)值法計算各樣本中Hoxa5相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量。利用SPSS 17.0軟件中t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,結(jié)果以平均值±標準差表示,以 P＜0.01作為差異極顯著性判斷標準[14]。

1.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Western Blotting檢測Hoxa5基因蛋白表達 樣品分為對照組和試驗組。每個樣品3個平行。用細胞裂解液提取細胞總蛋白,收集置于-20℃凍存?zhèn)溆?β-actin作為內(nèi)參。蛋白樣品回收后轉(zhuǎn)印,5%BSA封閉2 h;TBST洗膜3次,每次5 min;將一抗用1∶2 000比例稀釋,孵育膜4℃過夜;用TBST洗膜3次,每次5 min。山羊抗兔的二抗用以1∶2 000的比例稀釋,孵育膜1 h;用TBST洗膜3次,每次5 min,在暗室中曝光。條帶用ImageJ軟件分析,同一樣本不同處理的結(jié)果用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗,多組數(shù)據(jù)之間應(yīng)用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Hoxa5基因PCR擴增 以敖漢細毛羊的肌肉組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,應(yīng)用設(shè)計的上下游引物進行PCR擴增目的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示,電泳結(jié)果表明,引物擴增的條帶單一,產(chǎn)物大小為804 bp,與已知的目的基因大小一致,可用于后續(xù)的試驗。

2.2 TA克隆測序比對 將擴增的目的基因片段與pGM-T載體連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ,37℃過夜振蕩培養(yǎng)。將菌液送至擎科公司進行測序,測序后的序列用BLAST與已知目的基因的序列進行比對,比對結(jié)果顯示堿基沒有發(fā)生突變,與已知目的基因完全一致。

圖1 Hoxa5基因PCR擴增

2.3 克隆載體的鑒定 將擴增的目的基因連接到pGM-T載體中,經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ,過夜振蕩培養(yǎng)后對克隆載體利用試劑盒進行提取,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖2所示,目的基因大小為804 bp,T載體大小為3 489 bp,連接上目的基因后應(yīng)在4 293 bp處,條帶清晰單一,結(jié)果顯示克隆載體構(gòu)建提取成功,可用于后續(xù)的酶切試驗。

圖2 克隆載體的鑒定

2.4 克隆載體及pcDNA3.1載體雙酶切 對克隆載體和pcDNA3.1載體分別進行雙酶切,克隆載體的雙酶切將目的基因片段切下,pcDNA3.1的雙酶切把載體切開,對兩者雙酶切之后的片段進行切膠回收用于后續(xù)的連接。結(jié)果如圖3所示,1～2酶切效果良好1、2是對克隆載體的EcoR1、Nde1雙酶切,目的基因為804 bp,T載體為3 489 bp,與圖中條帶所吻合。3～4是對pcDNA3.1的雙酶切,大小為5 428 bp,與圖中條帶所吻合。因此1～4可進行目的基因與表達載體pcDNA3.1的連接。

圖3 克隆載體及pcDNA3.1載體雙酶切

2.5 表達載體pcDNA3.1構(gòu)建及鑒定 對克隆載體和pcDNA3.1載體EcoR1、Nde1雙酶切產(chǎn)物進行切膠回收后用T4 DNA連接酶將目的片段和pcDNA3.1載體進行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,37℃過夜振蕩培養(yǎng),對菌液進行PCR電泳鑒定,如圖4所示,在804 bp處有單一明亮的條帶,說明目的基因與pcDNA3.1載體連接成功。

圖4 表達載體pcDNA3.1的鑒定-PCR擴增

2.6 表達載體菌液測序鑒定 對目的基因Hoxa5連接到pcDNA3.1載體的菌液送至公司進行測序,測序結(jié)果與已知目的基因的序列用BLAST進行比對,結(jié)果顯示堿基完全一致,沒有堿基發(fā)生突變。說明目的基因成功的連接到了pcDNA3.1載體中去,并能夠穩(wěn)定的存在。

2.7 細胞形態(tài)觀察 每天定時用電子倒置顯微鏡觀察成纖維細胞的生長情況。細胞生長24 h可觀察到組織塊附近有梭形、不規(guī)則三棱形的成纖維細胞游離生長,除此細胞外還有橢圓形或圓形的上皮樣細胞生長。當細胞密度達到90%左右時進行傳代,采用胰酶消化法和差速離心法可將成纖維細胞和上皮樣細胞及其他細胞分離開,經(jīng)3～4代培養(yǎng)的細胞僅剩成纖維細胞,經(jīng)傳代后細胞增殖加快,細胞形態(tài)上不發(fā)生明顯的變化。

圖5 成纖維細胞原代培養(yǎng) (×100)與成纖維細胞傳代培養(yǎng) (×100)

2.8 實時熒光定量PCR檢測Hoxa5基因表達 以cDNA為模板,應(yīng)用設(shè)計的上下游引物進行PCR擴增目的基因Hoxa5和內(nèi)參基因GAPDH片段。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖6所示,電泳結(jié)果表明,引物擴增的條帶單一,GAPDH產(chǎn)物大小為125 bp,Hoxa5產(chǎn)物大小為186 bp與已知的內(nèi)參基因、目的基因大小一致,可用于熒光定量PCR試驗。

圖6 內(nèi)參基因GAPDH(A)目的基因Hoxa 5擴增產(chǎn)物(B)

由圖7可見,Hoxa5和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線峰值圖只有1個明顯的峰,表明在實時熒光定量PCR過程中熒光信號均來自特異性擴增產(chǎn)物,Hoxa5和GAPDH均沒有產(chǎn)生非特異性擴增及引物二聚體,引物可以用來進行下一步試驗。采用SPSS軟件對轉(zhuǎn)染的細胞和沒有進行轉(zhuǎn)染的細胞mRNA表達量進行分析,Hoxa5基因經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)染成纖維細胞后與未進行轉(zhuǎn)染的細胞之間差異顯著(P＜0.05)見圖8。

圖7 Hoxa 5和GAPDH熔解曲線峰值圖(A)和擴增曲線圖(B)

圖8 Hoxa 5基因mRNA相對表達量

2.9 Hoxa5基因蛋白表達的檢測 以成纖維細胞提取的蛋白為模板進行Western Blot。試驗結(jié)果顯示,試驗組細胞瞬時轉(zhuǎn)染Hoxa5基因的條帶明顯亮、粗與未轉(zhuǎn)染的對照組,經(jīng)ImageJ和SPSS分析得試驗組細胞瞬時轉(zhuǎn)染Hoxa5基因蛋白的表達顯著高于對照組(P＜0.05),說明質(zhì)粒pcDNA3.1-Hoxa5能高效表達Hoxa5基因。

圖9 Hoxa 5基因表達蛋白條帶

圖10 Hoxa 5基因蛋白相對表達量

3 討論

毛囊發(fā)育和周期性生長過程中受多種信號通路調(diào)控。這些信號分子73.2%屬于Wnt轉(zhuǎn)化生長因子家族、絲裂原活化蛋白激酶家族、NOTCH、JAK-STAT和SHH 6個傳導通路[15]。還有一部分屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族、成纖維細胞生長因子家族、BMP家族等。在毛囊發(fā)育過程中,雖然有一些其他分子的參與,但是這些分子大部分是通過上述的6個信號通路參與毛囊的發(fā)育過程。Hoxa5作為Hox家族重要成員之一,其編碼蛋白是與發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)[16],Hox家族成員調(diào)節(jié)人體白色與棕色脂肪發(fā)育,并且在身體不同部位脂肪組織中的表達有很大差異,Hoxa5的甲基化水平調(diào)節(jié)著小鼠不同部位脂肪細胞的分化[17]。柳楠等[18]研究發(fā)現(xiàn),通過基因芯片技術(shù),篩選出在羊皮膚毛囊中表達的Hox基因家族中的基因,在羊的肩部(多毛區(qū))和腹部有顯著的表達,在此過程中主要調(diào)控毛干的分化。

本研究選擇易培養(yǎng)活力高的成纖維細胞作為研究工具。選取子三代進行轉(zhuǎn)染,避免了轉(zhuǎn)染過程中摻雜了其他的細胞,減少了試驗的誤差。Hoxa5基因在成纖維細胞中能夠穩(wěn)定的存在并表達。首先,在mRNA的水平通過實時熒光定量PCR來檢測Hoxa5基因的表達。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組的mRNA量顯著高于空白對照組的量。其次,已知Hoxa5蛋白分子量約為30 kD,經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞Hoxa5基因蛋白表達量明顯高于空白對照。經(jīng)過顯色曝光后條帶明顯比對照組的條帶黑、寬。經(jīng)Image J分析,相對表達的灰度值也明顯高于對照組。將目的基因Hoxa5與內(nèi)參基因β-actin的灰度值的比值進行SPSS分析,結(jié)果顯示差異極顯著。進一步說明了轉(zhuǎn)染后Hoxa5基因的過表達。

目前尚未發(fā)現(xiàn),Hoxa5基因在細胞水平上的表達量與羊毛性狀和毛囊密度之間關(guān)系的研究報道,本試驗可對此起到補充作用。本研究通過基因的克隆,成功的構(gòu)建了Hoxa5基因表達載體,將載體轉(zhuǎn)染到成纖維細胞中,采用實時熒光定量PCR、Western Blot來檢測基因的表達,從而來進一步的研究基因的作用。經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞,Hoxa5基因的mRNA和蛋白表達量明顯的升高,這從細胞層次上研究了與羊毛有關(guān)的基因。Hoxa5基因本身具有抑制毛囊發(fā)育的作用,通過在細胞層次上的研究Hoxa5基因過表達,Hoxa5基因過表達的同時也將影響相關(guān)信號通路中基因的表達。Hoxa5基因的過表達,會影響與它相關(guān)的基因表達增強與減弱。這為以后的個體水平上的研究提供了堅實的基礎(chǔ),極大可能的解決綿羊羊毛生長的問題。

4 結(jié)論

本研究通過對Hoxa5基因質(zhì)粒的構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成纖維細胞后進行實時熒光定量PCR、Western Blot等,結(jié)果成功地構(gòu)建了質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染成纖維細胞,轉(zhuǎn)染后細胞生長良好,Hoxa5基因過表達,mRNA表達量和蛋白的表達量極顯著高于對照組,為進一步在個體水平上研究其功能奠定基礎(chǔ)。