簡瑩娜,張學(xué)勇,李秀萍,王光華,蔡其剛,王戈平,馬利青

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,青海 西寧 810016;2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810016)

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,M.gallisepticum)是引起雞呼吸困難、氣囊炎等癥狀的慢性呼吸道疾病的病原體,雞毒支原體感染又稱為慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease,CRD)。M.gallisepticum感染的臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、呼吸時發(fā)出啰音,嚴重時張口呼吸,在集約型的雞養(yǎng)殖場中容易發(fā)生CRD;CRD在世界各地均有發(fā)生,該病通過水平和垂直方式傳播,且極易在雞場中隱性存在蔓延。據(jù)統(tǒng)計,M.gallisepticum的雞群血清學(xué)調(diào)查感染率50%以上[1-2],感染此病后,雞群的產(chǎn)蛋率下降、體重減輕、出欄周期延長,且飼料轉(zhuǎn)化率降低,不僅增加額外藥費開支,而且引起禽產(chǎn)品的藥物殘留,所以此病是威脅養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。脂蛋白(Lipoprotein,LP)是M.gallisepticum的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一,在M.gallisepticum與宿主間相互作用中發(fā)揮重要作用,脂蛋白在M.gallisepticum的毒力及致病性中也具有重要的生物學(xué)作用：粘附作用,致炎性反應(yīng)和誘導(dǎo)細胞凋亡[3]。本文對雞場中的疑似M.gallisepticum感染的病雞進行病原的分子生物學(xué)鑒定,并對其脂蛋白基因進行克隆及全面的生物信息學(xué)分析,為進一步研究其生物學(xué)功能及其在疫苗和藥靶研究中的應(yīng)用提供線索。為了更好地分析脂蛋白抗原相位變異及其基因多態(tài)性,以及脂蛋白變異在支原體致病力方面的影響和重要生物學(xué)意義提供一定數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集處理 對疑似雞毒支原體病雞尸體進行臨床癥狀觀察,切開氣道觀察氣管黏膜及氣囊、肺臟。其次,剪取0.5 cm3大小的組織塊分別放入新的Eppendorf管中,用剪刀剪碎組織,利用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作步驟按照試劑盒使用說明書進行,DNA置于-20℃長期保存。

1.2 分子生物學(xué)鑒定 利用雞毒支原體crmA基因[9]和lipoprotein基因[10]建立的檢測方法,設(shè)計引物及實驗反應(yīng)程序進行PCR鑒定。PCR方法所用的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(見表1)。PCR擴增酶為寶生物工程(大連)有限公司的PremixTaq酶,擴增反應(yīng)體系如表2。擴增后產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳,再在凝膠成像儀中觀察拍照。

表1 雞毒支原體分子鑒定所用引物

表2 PCR反應(yīng)液配制 (體系為50 μL)

1.3 基因測序分析 PCR陽性產(chǎn)物測序委托北京金唯智生物科技有限公司完成,采用Sanger雙脫氧鏈終止法進行雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)峰圖分析后,再在GenBank上用BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源序列搜索,應(yīng)用MEGA5.0軟件進行比對分析。

1.4 脂蛋白(部分)特性分析 將lipoprotein基因翻譯成蛋白序列,雙向比對后在ExPASy(http：//www.expasy.org/)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中,進行蛋白特性預(yù)測。采用 TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/ser-vices/SignalP/)程序分析LP蛋白的分泌信號肽和信號肽酶剪切位點;利用HMMTOP(http：//www.enzim.hu/hmmtop/index.php)和TMHMM-2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析LP蛋白的跨膜區(qū)域,應(yīng)用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)分析LP蛋白質(zhì)的親/疏水性。采用 SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件進行LP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用Predicted Antigenic Peptides(http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)進行抗原表位分析。

1.5 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務(wù)軟件獲取其他雞毒支原體的LP蛋白的基因序列。使用MEGA5.0軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能對這些基因序列進行分析,選擇鄰近法(Neighbor-Joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并使用自展值(Bootstrap)檢驗其可靠性,重復(fù)次數(shù)為2 000,分析不同分離株雞毒支原體lipoprotein基因間的進化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 分子生物學(xué)鑒定 使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后,基于crmA基因進行PCR擴增,擴增出288 bp的目的片段(如圖1);同時基于lipoprotein基因再次進行PCR擴增鑒定,擴增出726 bp的目的片段(如圖2),將PCR產(chǎn)物進行測序,所得序列在GenBank用BLAST進行同源序列搜索并上傳至GenBank,均與M.gallisepticum S6株全基因組比對(CP006916)同源性均在95%以上。

圖1 CrmA基因擴增結(jié)果

圖2 lipoprotein基因擴增結(jié)果

2.2 脂蛋白基本性質(zhì)分析 經(jīng)過ExpASy在線系統(tǒng)分析,此段LP蛋白長度214個氨基酸,分子量大小為23.74 kDa,等電點(pI)為4.99;帶正(Arg+Lys)負(Asp+Glu)電荷氨基酸殘基數(shù)為20和24。LP蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為20 400 mol-1·cm-1及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值為0.859;LP在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為15.88(閾值＜40),推測LP為穩(wěn)定蛋白;LP的脂肪族指數(shù)為59.72,親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.703,蛋白總體親水性較低。此段LP蛋白序列信號肽預(yù)測cutoff值為0.450(＜0.9),此段蛋白無信號肽和信號肽酶剪切位點。預(yù)測可見,LP蛋白為非跨膜蛋白,為膜外蛋白且是疏水蛋白;LP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)α螺旋比例為37.85%,β轉(zhuǎn)角比例為9.81%,無規(guī)則卷曲比例為39.72%,延伸鏈比例為12.62%,可見LP蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主(如圖3)。對LP蛋白的氨基酸序列中潛在的抗原表位做進一步分析,顯示有5個潛在的抗原表位,且平均抗原傾向性系數(shù)為0.9870,LP蛋白含有較多的優(yōu)勢抗原表位結(jié)構(gòu),可作為一種免疫原性蛋白。

圖3 脂蛋白預(yù)測三維構(gòu)象圖

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過MAGE5.0軟件構(gòu)建的NJ樹如圖4所示,其中本研究克隆序列(Gen-Bank登錄號KY088057)與美國分離株AY556082聚在一支,可見在系統(tǒng)發(fā)育樹上發(fā)現(xiàn)二者之間的進化距離最近。這為后續(xù)從分子遺傳學(xué)角度探索lipoprotein基因功能提供研究思路。

3 討論

圖4 不同分離株雞毒支原體lipoprotein基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

本試驗鑒定的M.gallisepticum,分離自養(yǎng)殖場的疑似雞毒支原體病例,采用PCR方法利用crmA基因和lipoprotein基因進行分子鑒定,都獲得了預(yù)期片段大小,通過對相應(yīng)樣品進行測序,進一步確認為M.gallisepticum。由于M.gallisepticum引起的慢性呼吸道病為接觸性傳染病很難凈化,可以在雞場中長期蔓延,且易復(fù)發(fā),加上與其他疾病如大腸桿菌病和傳染性支氣管炎等并發(fā)或繼發(fā)感染[7]。特別是在集約化程度較高、管理不善、環(huán)境不佳、氣溫驟變等因素都會促進M.gallisepticum隱性感染的雞群發(fā)病或引起M.gallisepticum的感染[6-7]。M.gallisepticum單獨感染多呈現(xiàn)亞臨床感染癥狀,死亡率較低,基本在10%以下,與其他病原混合感染或繼發(fā)感染時,M.gallisepticum感染加重,死亡率會提高至30%以上[8-9]。在我國的廣東省、廣西省、山東省的雞場都曾發(fā)生呼吸道疾病,且鑒定分離到M.gallisepticum[10-12],同時在西藏和青海地區(qū)自然養(yǎng)殖與集約化養(yǎng)殖的雞群中也廣泛流行著由M.gallisepticum感染引起的呼吸道疾病[13-14]?？梢?M.gallisepticum感染已成為威脅養(yǎng)雞業(yè)的隱形病原。

新型有效的疫苗是預(yù)防M.gallisepticum感染的有效手段,但是其表面抗原具有不斷改變的能力,且通過抗原變異性來逃避宿主的免疫抵抗[5],因此對重要結(jié)構(gòu)蛋白之一的脂蛋白基因進行克隆分析,該蛋白總體親水性較低,為疏水性蛋白,二級結(jié)構(gòu)包括α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈。同時發(fā)現(xiàn),脂蛋白有5個潛在的優(yōu)勢抗原表位,可作為一種免疫原性蛋白。這些分析為該蛋白功能的進一步研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

M.gallisepticum作為引起雞慢性呼吸道病的主要病原之一,可能在本地區(qū)長期存在蔓延感染,造成養(yǎng)雞業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。因此,對本地區(qū)分離株病原進行分子鑒定研究,對診斷預(yù)防該病的發(fā)生都具有重要的現(xiàn)實意義;借此提示控制此病的發(fā)生流行,堅持疫苗和藥物預(yù)防,加強飼料營養(yǎng)管理,注重禽舍內(nèi)通風(fēng)空氣交換,控制疾病水平傳播,注意處理種蛋的垂直傳播,凈化雞群,積極防治M.gallisepticum感染的發(fā)生。