程善菊,李金平,侯廣宇,彭 程,王素春,蔣文明,溫建新

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島 266032)

禽流感是一種禽類全身性或者以呼吸癥狀為主的傳染病[1],由正黏病毒科A型流感病毒屬禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起。根據(jù)致病力的不同AIV可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒[2]。H3亞型AIV分離率較高,屬于低致病性禽流感病毒,其致病力雖然低,但危害持久,能夠長期的存在于家禽體內(nèi)[3]。并且,感染范圍比較廣,不僅能感染禽類,在哺乳動物豬、馬、犬等體內(nèi)也可以分離到[4]。有研究發(fā)現(xiàn),AIV還與人的H3亞型流感病毒有密切聯(lián)系,1968年發(fā)生于香港的人流感病毒HA和PB1基因,就是來源于禽類[5]。另外,有些H3亞型流感病毒能夠與H9N2和H5N1亞型流感病毒發(fā)生基因重組[6],人源以及禽源流感病毒還能通過豬這個“混合器”發(fā)生基因重排[7],基因重排能造成AIV致病性變強,給禽流感的防控帶來很大難度。因此,對家禽進行長期的AIV分子流行病學(xué)檢測,密切關(guān)注AIV傳播和進化情況,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本試驗以2016年至2017年在我國部分省市活禽市場的家禽體內(nèi)分離得到的14株H3亞型禽流感病毒為研究對象,對其進行全基因測序和遺傳進化分析,并對H3亞型AIV的遺傳進化關(guān)系和流行情況進行分析,以期對H3亞型AIV的進化研究提供一些參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株 本試驗14株H3亞型禽流感毒株來源省份與具體監(jiān)測情況見表1,毒株由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離鑒定并保存。10日齡SPF雞胚,購自青島市城陽區(qū)康信種雞場。

表1 14株H3亞型AIV監(jiān)測情況

1.2 主要試劑 病毒RNA純化試劑盒(凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司);膠回收試劑盒,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;連接試劑盒,購自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司;大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 病料采集與處理 采集健康家禽的咽拭子和泄殖腔拭子,并將其放入PBS緩沖液中,充分混勻后抽取2 mL接種10日齡雞胚,收集在24～96 h死亡及未死亡雞胚尿囊液,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒RNA提取、RT-PCR及膠回收 按照RNA抽提試劑盒提取病毒的RNA,RT-PCR擴增體系采用 25 μL體系,其中 2×One Step Mix為12.5 μL,上下游引物各 1 μL,酶為 1.25 μL,模板為3 μL,純水6.25 μL。 反應(yīng)程序：55 ℃ 30 min,94 ℃2 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,35個循環(huán),72℃ 5 min,4℃保存。將25 μL擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠里進行電泳,切取目的條帶,按照膠回收試劑盒說明書進行回收純化。

1.3.3 連接轉(zhuǎn)化 將膠回收后的產(chǎn)物與P Clone EZ-TOPO載體進行連接。然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進行轉(zhuǎn)化,挑取單個菌落,進行PCR鑒定,選擇陽性克隆菌,將菌液送往青島睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.3.4 序列的拼接與分析 采用DNAStar軟件中Seqman對測定的各個基因序列進行拼接,用MegAlign軟件進行序列比對,得到完整序列后利用軟件MEGA 7.0制作進化樹并分析。

2 結(jié)果

2.1 全基因RT-PCR擴增結(jié)果 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,14株分離株各基因擴增片段與預(yù)期擴增大小相符。

2.2 全基因測序結(jié)果與序列分析

2.2.1 血凝素(HA)基因序列分析 14株H3亞型禽流感毒株 HA基因HA1區(qū)編碼344個氨基酸,HA2區(qū)編碼221個氨基酸,共編碼565個氨基酸,沒有發(fā)生核苷酸插入和缺失的現(xiàn)象。將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,結(jié)果顯示,14株H3亞型分離株HA基因上均存在6個潛在的糖基化位點,分別是位于 HA1 基因上的22/24、38、54、181,301,HA2 基因上499。而且14株毒株HA基因裂解位點氨基酸序列均為340PEKQTR↓GLF348均只有一個堿性氨基酸,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。14株毒株的HA基因氨基酸位點在226、228分別為Q、G(人源為226(L)、228(S)),符合典型的禽源特征[8]。另外,位點190(E)和225(G)是維持唾液酸α-2,3-半乳糖受體重要結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點,并未發(fā)生突變,有關(guān)HA基因特征性位點詳見表2。

遺傳進化分析表明,14株毒株之間核苷酸同源性在82.9% ～99.3%之間,其氨基酸序列同源性為91.2% ～98.5%。HA基因進化樹如圖1,觀察進化樹可知14株毒株HA基因均屬于歐亞分支,在歐亞分支中又分出3個獨立小分支。毒株 JE176、JE179、H1105、X2108、X2130、HE218、GX1248 在同一分支,核苷酸同源性為88.2% ～98.7%,其中毒株JE179與安徽參考毒株A1651同源性最高,為94%。 Q2113、Q2230、X2403、H2171、F1142、X2420在同一分支,核苷酸同源性為87.1% ～99.3%,其中毒株H2171與蒙古參考毒株2076同源性最高,為96.5%。毒株J1099單獨一個分支,與廣西參考毒株175D12同源性最高,為94.5%。14株毒株在相近年份的同源性較高顯示出一定的年代性,遺傳進化上與豬源人源不在同一分支,說明親緣關(guān)系較遠。

表2 14株H3亞型分離毒株HA基因特征性位點

圖1 HA基因遺傳進化樹

2.2.2 神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列分析 NA基因共編碼470個氨基酸,沒有發(fā)生核苷酸缺失現(xiàn)象。14株H3亞型分離株中有7株H3N2,5株H3N8,2株H3N3,在蛋白質(zhì)氨基酸序列中,預(yù)測其潛在的糖基化位點,其中7株H3N2中X2130、Q2230、Q2113、X2403、X2108、J1099均存在6個潛在糖基化位點,在氨基酸序列中位點為 61、69、86、20、234、402,其中J1099在第69位為 NST其余均為NNT,毒株H1105在306位增加了一個糖基化位點NMT。5株H3N8中 X2420、GX1248、HE218、F1142 均存在 6個潛在糖基化位點,在氨基酸序列中位點分別為46、54、67、84、144、293,毒株 JE176 糖基化位點在42位增加了一個 NES。在2株 H3N3中毒株JE179 在位點 14、57、66、72、146、235、307 存在 6個潛在糖基化位點,毒株H2171糖基化位點在23位增加了一個 NGT。氨基酸位點119E、152R、274H、292R、294N是NA基因可能的耐藥性位點,均未發(fā)生變異。

14株毒株中7株H3N2核苷酸同源性在88.2% ～99.8% 之間,氨基酸序列同源性在88.2% ～99.8%之間。5株H3N8核苷酸同源性在79.1% ～99.0% 之間,氨基酸序列同源性78.6% ～98.0%。2株H3N3核苷酸同源性為96.0%,氨基酸序列同源性為97.5%。14株分離株NA基因遺傳進化樹如圖2,不同亞型之間共分為3個小分支,其中Q2230與湖南參考毒株139同源性最高,為95%。H2171與江西參考毒株26175同源性最高,為96.5%。HE218與湖南參考毒株S1824同源性最高,為97.7%。處于同一分支的毒株親緣關(guān)系較近,可能來源于相同祖先。

圖2 NA基因遺傳進化樹

2.2.3 內(nèi)部基因序列特殊位點分析 對14株H3亞型分離株的內(nèi)部基因序列進行分析,結(jié)果表明,PB2基因編碼區(qū)由2280個核苷酸組成,共編碼759個氨基酸。PB2基因的第627(E)和701(D)是哺乳動物適應(yīng)性關(guān)鍵位點,與人源的627(K)和701(N)不同[9]。PB1的編碼區(qū)共有2 274個核苷酸,編碼757個氨基酸,PB1-F2蛋白共有90個氨基酸編碼,沒有發(fā)生終止密碼子的提前終止[10]。PB1基因的位點198(K)和317(M)被認(rèn)為與小鼠的致病性有關(guān)[11]。PA基因第97位為蘇氨酸(Thr)而不是異亮氨酸(Ile),異亮氨酸(Ile)可以使毒力顯著增強,對病毒的毒力有非常大的影響[12]。14株分離株M1基因編碼252個氨基酸,M2基因編碼97個氨基酸,M1相對保守,M2蛋白所含的特異性氨基酸 11(T)、14(G)、16(E)、20(S)和57(Y)未發(fā)生變異符合禽流感病毒特征。NS1蛋白的第92位氨基酸為天冬氨酸(Asp)而不是谷氨酸(Glu),谷氨酸(Glu)對拮抗干擾素和腫瘤壞死因子介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)具有重要作用[13]。

遺傳分析表明,14株分離株核苷酸同源性分別為,PB2基因92.9% ～100%,PB1基因87.0% ～97.4%,PA基因85.4% ～97%,NP基因87.8% ～99.7%,NS基因71.5%～99.5%,M基因92.9%～100%。各個內(nèi)部基因進化樹如圖3、4、5、6、7、8,其中毒株 A/Duck/Fujian/F1142/2016(H3N8)的NS基因為北美分支,其余毒株均為歐亞分支。

圖3 PB2基因遺傳進化樹

圖4 PB1基因遺傳進化樹

3 討論

本試驗對14株H3亞型禽流感病毒的全基因進行了測序與序列分析,結(jié)果表明,HA基因在其裂解位點均為340PEKQTR↓GLF348,只有一個堿性氨基酸,能被特定蛋白酶識別,符合低致病性禽流感特征。14株分離毒株的HA基因氨基酸位點在226、228分別為Q、G而人源為226(L)、228(S),具有典型的禽源特征。有研究表明,HA基因上潛在的糖基化位點還能夠影響AIV的毒力[14],對14分離株HA基因潛在的糖基化位點進行了分析,有部分毒株第24位氨基酸發(fā)生突變,導(dǎo)致24位(NST)糖基化位點消失,但是出現(xiàn)了新的糖基化位點22(NDS)。另外部分毒株NA基因糖基化位點也發(fā)生了增加現(xiàn)象,新出現(xiàn)的糖基化位點對AIV毒力的影響還需進一步試驗驗證。

圖5 PA基因遺傳進化樹

圖6 NP基因遺傳進化樹

圖7 M基因遺傳進化樹

圖8 NS基因遺傳進化樹

14株分離毒株來自我國2016年至2017部分省市活禽市場,其中除了NS基因的A/Duck/Fujian/F1142/2016(H3N8)毒株為北美譜系外其余各基因均為歐亞分支。觀察進化樹可知分離年份相近的的毒株,親緣關(guān)系較近,各個基因核苷酸序列同源性高,可能來自相同的祖先。AIV容易通過抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變發(fā)生變異,產(chǎn)生具有新的抗原特征的流感病毒。由于H3亞型 AIV致病力較低,在流行病學(xué)中的作用常被忽視,低致病性禽流感病毒感染家禽后雖然表現(xiàn)溫和,但是存在的臨床危險不容忽視,通過基因重排低致病性禽流感很有可能為形成高致病性禽流感病毒提供基因片段,因此必須加強對H3亞型禽流感病毒的監(jiān)測。