段欣強(qiáng),張洪亮,周保琨,楊瑞梅,單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266109;2.山東省即墨區(qū)畜牧獸醫(yī)局,山東 青島 266200)

犬細(xì)小病毒病(CPD),是由犬細(xì)小病毒(CPV)感染犬的一種致死性、急性、高傳染性疾病。CPV是細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒屬成員,該屬成員有水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)等,相似性達(dá)到90%[1]。CPV形態(tài)呈六角形或圓形,呈等軸對稱的二十面體結(jié)構(gòu),衣殼蛋白無囊膜。CPV為單股、負(fù)鏈、線性DNA病毒,基因組全長5.3 kb,VP2基因占90%,而VP1基因僅為10%。VP2是其衣殼蛋白的主要成分,基因全長1 755 bp,編碼584個(gè)氨基酸。VP2是CPV的免疫原性蛋白,CPV的主要抗原決定簇,可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,是制備CPV基因工程疫苗的關(guān)鍵保護(hù)性抗原[2]。

乳酸球菌是乳酸菌的典型代表,現(xiàn)已研究獲得完整基因組序列[3],產(chǎn)出的外源目的蛋白可直接使用,使其與動物機(jī)體相互作用。乳酸球菌成為活載體疫苗意向菌株有突出優(yōu)勢[4]：(1)乳酸球菌為食品級菌種,無強(qiáng)抗原性,有別其他活疫苗載體菌,如：大腸桿菌、痘病毒和沙門菌等;(2)該菌種自身分泌蛋白較少,已知其分泌出的Usp 45是唯一可檢測蛋白,減輕了菌種對外源重組蛋白的干預(yù);(3)乳酸球菌不產(chǎn)任何蛋白酶到胞外,使外源重組蛋白不發(fā)生胞外降解。

活載體疫苗是以基因工程技術(shù)編碼靶抗原或具有特殊生理功能的蛋白的DNA片段重組入病毒的共生菌或病原菌中,連接載體能夠高效表達(dá),后用載體疫苗免疫動物機(jī)體,有效激發(fā)動物機(jī)體的免疫應(yīng)答,以防治動物病毒病為宗旨。鑒于此,對CPV VP2基因組進(jìn)行分析研究,構(gòu)建重組乳酸菌表達(dá)載體,通過乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白,為后續(xù)檢測及構(gòu)建CPV病毒樣粒子口服疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞來源 CPV-2a株、乳酸球菌MG1363、表達(dá)載體 pMG36e均為本實(shí)驗(yàn)室收存;E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞,購自TaKaRa公司;犬細(xì)小病毒陽性血清,購自杭州格朗瑞生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 DNAiso Reagent、dNTP、EX Taq、pMD TM19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA Ligase、Quick Cut XbaⅠ、Quick Cut Hind Ⅲ、DL-5 000 DNA Marker,均購自TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒,購自O(shè)MEGA(美國);高純度質(zhì)粒提取試劑盒,購自TIANGEN生化科技;30%丙烯酰胺、4X蛋白上樣緩沖液(含DTT)、兔抗狗IgG-HRP單抗,購自索萊寶科技有限公司;預(yù)染蛋白Marker(10-180 kD),購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;His-tag Protein Purification Kit,購自碧云天生物技術(shù)研究所;ProFlexTMPCR儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、SDSPAGE電泳儀、Western Blot膜轉(zhuǎn)儀(Bio-RAD)、MicroPulserTMElectroporator電轉(zhuǎn)儀。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)CPV-2a毒株VP2基因序列(GenBank登錄號：JQ743906.1),使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物。上游引物：5′-TGCTCTAGA ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′(下劃線為XbaⅠ酶切位點(diǎn));下游引物：5′-CCCAAGCT TATGGTGATGGTGATGATG ATATAATTTT CTAGGTGCTAGT-3′(單下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn),雙下劃線為6×His標(biāo)簽),預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 755 bp。引物經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,以ddH2O稀釋到工作濃度,-20℃收存待用。

1.4 病毒DNA的制備 參考TaKaRa公司的DNAiso Reagent試劑說明書提取步驟對CPV-2a細(xì)胞病毒液進(jìn)行DNA提取。制備成PCR擴(kuò)增模板,裝于1.5 mL離心管,-20℃收存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因片段的PCR擴(kuò)增 以所提CPV-2a株DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因片段,PCR擴(kuò)增體系 (25 μL)：ddH2O 17 μL,10 × Ex Taq Buffer(Mg2+)2.5 μL,dNTP Mix ture 2 μL,上、下游引物(100 μmol/mL)各 0.5 μL,模板 DNA 2 μL,Ex Taq Polymerase 0.5 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min,最后PCR產(chǎn)物4℃收存。

取25 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,同時(shí)設(shè)定陽性、陰性對照,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外凝膠成像系統(tǒng)上成像并拍照。以膠回收試劑盒回收和純化PCR產(chǎn)物凝膠。

1.6 CPV-VP2基因的克隆與測序 純化的PCR目的產(chǎn)物連接pMDTM19-T simple載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài),通過細(xì)菌培養(yǎng)、提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR凝膠電泳鑒定,選出陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。根據(jù)NCBI網(wǎng)站Blast程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行分析,鑒定TA克隆所得的CPV-VP2序列的基因型;與GenBank中登錄的10株國內(nèi)外CPV-2a分離株VP2基因進(jìn)行比對,比對結(jié)果正確。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 選取1個(gè)帶CPV-2a序列的質(zhì)粒,利用基因片段兩端的酶切位點(diǎn)對陽性質(zhì)粒雙酶切,回收純化后和同樣酶切處理的乳酸菌表達(dá)載體pMG36e 16℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,涂于紅霉素抗性為(0.3 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基,37℃溫箱培養(yǎng)過夜,挑取單菌落,接種于紅霉素抗性(0.2 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,190 r/min震蕩培養(yǎng)14 h,提取質(zhì)粒,并通過菌液PCR及雙酶切進(jìn)行初步鑒定,取陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,利用上述序列比對方法鑒定重組質(zhì)粒,比對結(jié)果正確。

1.8 VP2蛋白的表達(dá)及SDS-PAGE、Western Blot-ting鑒定 構(gòu)建的陽性質(zhì)粒pMG36e-VP2經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化至乳酸菌MG1363感受態(tài)細(xì)胞并劃線于帶紅霉素抗性的MRS平板,挑選單菌落,接種于含紅霉素抗性的GM17液體培養(yǎng)基,30℃燭缸中靜置孵育36 h,待渾后1∶100接種于10 mL MRS培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h至OD600值約為0.8,取10 mL該重組菌5 000 r/min離心5 min,用1 mL冰冷TES懸浮細(xì)胞,12 000 rpm/min(4℃)離心,棄上清。重復(fù)上述步驟,用140 μL含1 mg/mL溶菌酶的 TES重懸,37℃水浴30 min。加入60 μL 20%SDS混勻裂解菌體,加入60 μL 4X蛋白上樣緩沖液(含DTT),吹打混勻后沸水浴10 min。然后將其放置冰盒冷卻,取15 μL作為上樣量,剩余放-20℃保存。

在類比推理中，始源S和目標(biāo)T是兩個(gè)具有特定結(jié)構(gòu)的概念體系。用概念網(wǎng)絡(luò)，可以將兩個(gè)系統(tǒng)細(xì)致地描述出來。這個(gè)過程也是知識表達(dá)的過程。

30℃培養(yǎng)菌液,當(dāng)菌液孵育OD600值=0.6～0.8時(shí),加入NISIN誘導(dǎo),參照現(xiàn)有文獻(xiàn)[5],對重組菌株做3個(gè)濃度篩選,分別為：20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL,分別加入10 mL菌液中,30℃下靜置培養(yǎng)8 h,此時(shí)測得菌液濃度分別為：2.35×107CFU/mL、1.97×107CFU/mL、1.44×107CFU/mL。 取3個(gè)濃度菌液10 mL按上述步驟做蛋白樣品處理。

配制12%分離膠和5%濃縮膠,拼裝電泳槽并放入電泳儀,上樣后電壓調(diào)至80 V 30min,后調(diào)至120 V 1 h,待電泳完成后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色液染色3～5 h。待染色反應(yīng)完成后,加入脫色液進(jìn)行脫色,觀察結(jié)果。

通過Western Blot膜轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(0.45 μm),清洗后放入封閉液中封閉。清洗后,加以CPV陽性血清作一抗進(jìn)行孵育,清洗后,加兔抗狗IgG-HRP作二抗孵育,用增強(qiáng)型DAB顯色液對膜顯色。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增VP2目的基因 以CPV-2a細(xì)胞毒株全基因獲取的VP2基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果表明,在1 755 bp左右處出現(xiàn)1條特異性條帶,與預(yù)期目的片段大小一致(見圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pMG36e-VP2的鑒定及其酶切鑒定從大腸桿菌轉(zhuǎn)化搖菌培養(yǎng)的菌液中提取pMG36e-VP2質(zhì)粒,做瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果符合預(yù)期重組基因條帶大小。經(jīng)雙酶切,可獲得兩條特異性條帶,其中一條為目的基因片段,另一條為pMG36e載體片段,與預(yù)期結(jié)果一致,重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,分析測序結(jié)果正確。

圖1 CPV-2a細(xì)胞毒株VP2全基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將上述提取的重組質(zhì)粒pMG36e-VP2-MG1363經(jīng)Quick Cut XbaⅠ和Quick Cut HindⅢ雙酶切,可獲得兩條特異性條帶,其中一條長約1 755 bp的目的基因片段,另一條長約3 600 bp(pMG36e載體DNA片段),與預(yù)期結(jié)果一致(見圖2)。

圖2 重組質(zhì)料pMG36e-M1-MG1363雙酶切鑒定電泳圖

2.4 SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白表達(dá) 將pMG36e-VP2-MG1363重組乳酸球菌液孵育至OD600值=0.6～0.8,加入誘導(dǎo)劑Nisin誘導(dǎo),誘導(dǎo)完成后做上樣處理,經(jīng)SDS-PAGE電泳在65 kD左右出現(xiàn)一特異性蛋白條帶,與預(yù)期蛋白大小基本一致,而空載體轉(zhuǎn)化菌在其位置未出現(xiàn)特異條帶(見圖3)。下一步進(jìn)行Western Blotting檢測。

2.5 重組蛋白的Western Blot鑒定 結(jié)果顯示,通過Nisin誘導(dǎo)后,在65 kD左右處出現(xiàn)明顯特異性條帶(見圖4),表明該重組目的蛋白獲得高效表達(dá)并與CPV陽性血清作的一抗進(jìn)行特異性結(jié)合,具有良好免疫反應(yīng)性。

圖3 pMG36e-VP2-MG1363重組蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定

圖4 重組蛋白的Western Blot鑒定

3 討論

CPD具有發(fā)病急、病程短、傳染性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高的特點(diǎn),且根據(jù)我國及地區(qū)性寵物傳染病的流行病學(xué)形勢來看,家庭寵物和毛皮動物養(yǎng)殖方面受犬細(xì)小病毒危害較大。目前犬細(xì)小病毒病的預(yù)防以注射疫苗為主,主要使用CPV弱毒苗及滅活疫苗,具有較好效果,但仍需注射,口服疫苗則簡單易操作,且應(yīng)用益生乳酸菌為載體可改善腸道環(huán)境。本研究進(jìn)行了前期試驗(yàn)：以PCR擴(kuò)增CPV VP2全基因,連接乳酸菌表達(dá)載體pMG36e進(jìn)行重組,構(gòu)建了pMG36e-VP2重組表達(dá)載體,電轉(zhuǎn)化進(jìn)乳酸乳球菌MG1363,經(jīng)SDS-PAGE和Western Blotting鑒定目的蛋白成功表達(dá)。我們設(shè)計(jì)表達(dá)的重組蛋白在N端帶有6XHis標(biāo)簽,標(biāo)簽分子量小,基本不改變蛋白生物結(jié)構(gòu)和蛋白溶解性,便于純化目的蛋白。重組目的蛋白經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化,SDSPAGE和Western Blotting結(jié)果均獲得專一條帶,獲得蛋白純度高,蛋白量大,避免了雜帶影響,為體外自動組裝CPV病毒樣粒子提供科學(xué)支撐。

重組目的蛋白表達(dá)量不高時(shí),引入誘導(dǎo)劑乳酸鏈球菌素。乳酸鏈球菌素(亦稱乳鏈菌肽),簡稱Nisin,對食品腐敗菌和致病菌包含的許多革蘭陽性菌有強(qiáng)效的抑制作用。Nisin組成的NICE表達(dá)系統(tǒng)可根據(jù)需要把握外源蛋白的表達(dá)量,且誘導(dǎo)效率可為1 000倍以上[6]。因?yàn)檩d體pMG36e存在nisI基因,所以Nisin能夠誘導(dǎo)pMG36e-VP2的蛋白表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果鑒定重組蛋白表達(dá)量大,根據(jù)Nisin梯度篩選的蛋白濃度分別表示為：0.224 mg/mL、0.212 mg/mL、0.133 mg/mL,且表達(dá)正確在約 65 kD處存在目的蛋白。進(jìn)一步作Western Blotting檢測,結(jié)果表明,目的蛋白能與CPV陽性血清產(chǎn)生特異反應(yīng),說明該重組蛋白具有良好免疫反應(yīng)性。

CPV VP2蛋白外源重組表達(dá)一般有以下方式：真核表達(dá)系統(tǒng)主要是桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)等;原核表達(dá)系統(tǒng)主要是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)等。近年來,不少學(xué)者與研究人員已通過不同表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)CPV VP2目的蛋白。Hongli Jin等人[7]研究出CPV VP2在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)的研究。賀英等人[8]研究出CPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)。王園園[9]研究CPV VP2基因連接表達(dá)載體pET-32a,于E.coli BL21菌誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。上述CPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因不同表達(dá)方式與本研究相比,目的蛋白多以包涵體形式表達(dá),蛋白分子量多比天然VP2蛋白要大,且動物試驗(yàn)測定重組蛋白VP2生物學(xué)特征時(shí),必進(jìn)行注射處理,操作復(fù)雜、有誤差。本研究使用乳酸菌表達(dá)系統(tǒng),載體pMG36e本身不表達(dá),表達(dá)的重組目的蛋白的分子組成、理化性質(zhì)和生物學(xué)作用等因素與天然CPV病毒VP2蛋白更接近,乳酸菌安全、無內(nèi)毒素,重組目的蛋白可直接同菌體一起灌服,避免試驗(yàn)操作誤差。乳酸菌攜帶的重組蛋白不具包涵體,破菌后即可到胞外,乳酸菌本身分泌蛋白很少,試驗(yàn)操作便捷。