肖真真,湯明元,張鑫宇,夏曉莉,孫懷昌

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省重要動物疫病與人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

葡萄球菌是奶牛乳房炎重要病原菌,其中金黃色葡萄球菌也是人獸共患病原菌。凝固酶陰性葡萄球菌多達20多種,已取代金黃色葡萄球菌成為奶牛隱性乳房炎主要病原菌[1]。葡萄球菌幾乎能對所有抗生素產(chǎn)生耐藥性,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)廣泛流行引起了廣泛關(guān)注[2],迫切需要研制防治葡萄球菌新藥。

P128蛋白是由蛋白葡萄球菌噬菌體K細胞壁降解酶活性區(qū)與溶葡萄球菌素細胞壁結(jié)合區(qū)組成的嵌合蛋白,對MRSA等葡萄球菌具有很強溶(殺)活性[3]。國外用大腸桿菌成功表達了重組P128蛋白,但需兩步硫酸銨沉淀和離子交換層析純化[4]。本課題組曾以類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide,ELP)為純化標(biāo)簽,用腦膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件(Self-processing module,SPM)切割ELP標(biāo)簽,獲得了重組P128[5]蛋白,但切割效率較低,臨床應(yīng)用受到限制。

煙草蝕紋病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEVp)具有識別序列特異性強、切割活性高、影響因素少等優(yōu)點,廣泛用于重組蛋白標(biāo)簽切除[6]。本課題組將TEVp與自聚肽ELK16進行融合表達,表達的活性包涵體可用離心法純化,并可用離心法與酶切產(chǎn)物分離[7]。本研究以ELP為純化標(biāo)簽,用TEVp活性包涵體切割ELP標(biāo)簽,用獲得的重組P128蛋白對牛源葡萄球菌進行溶(殺)菌試驗,旨在為P128蛋白臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 原核表達載體pP128-SPMELP[6]、pP16P-TEVp[8]和pELP-Fh8由本室構(gòu)建;質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒,購自AXYGEN公司;限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、pMD19-T Simple載體和T4 DNA連接酶,購自TaKaRa(大連)公司;DH5α和BLR(DE3)大腸埃希菌從美國Invitrogen公司引進;ELK16自聚肽融合TEVp活性包涵體由本室制備[7];奶牛乳房炎相關(guān)葡萄球菌本室保存。

1.2 PCR擴增 根據(jù)P128蛋白編碼序列[4]設(shè)計1對PCR引物,正向引物引入SalI酶切位點和TEVp識別位點,序 列 為 5′-GCGTCGACA GAAAACCTGTACTTCCAGGGTGGTGCTCAGGACGGTGGT-3 ′;反向引物引入XhoI酶切位點,序列為5′-GCCTCGAGTTATTTGATGGTACCCCAC-3′。PCR擴增按照PrimeStar Max說明書進行,模板DNA為100 ng的pP128-SPM-ELP質(zhì)粒,正、反向引物各20 pmol/L,總體積50 μL。反應(yīng)條件為：94℃/5 min;94℃/30 s,58℃/40 s,72℃/40 s,35次循環(huán)。將PCR產(chǎn)物克隆入pMD19-T Simple載體,用測序法進行鑒定。

1.3 表達載體構(gòu)建 用限制酶 SalI和XhoI將P128蛋白編碼序列從pMD19-T Simple載體切下,與同酶線性化pELP-Fh8載體連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸埃希菌,在卡那霉素(50 μg/mL)瓊脂平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種卡那霉素LB,培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA,用SalI和XhoI雙酶切鑒定,重組載體命名為pELP-Fh8-P128。

1.4 融合蛋白表達 將pELP-Fh8-P128載體轉(zhuǎn)化BLR(DE3)大腸埃希菌,挑取單菌落接種卡那霉素LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜;按1∶100接種卡那霉素2×YT培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至OD600nm值=0.8,加入終濃度為0.1 mmol/LIPTG,37℃誘導(dǎo)表達6 h;4 000 r/min(4℃)離心10 min,沉淀菌體用PBS重懸,用超聲波破碎(25 W,裂解10 s,間歇20 s,共3 min);12 000 r/min(4℃)離心10 min,分別收集離心上清和沉淀,用12%SDS-PAGE分析融合蛋白表達及其可溶性。必要時對IPTG濃度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化。

1.5 融合蛋白純化 先用PBS將菌體裂解液蛋白濃度稀釋至10 mg/mL,各取200 μL,分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L 和3.0 mol/L 氯化鈉,26 ℃孵育10 min;室溫、12 000 r/min離心5 min,沉淀蛋白用預(yù)冷PBS(pH值7.4)重懸,各取10 μL進行12%SDS-PAGE分析。然后取稀釋菌體裂解液各200 μL,加入優(yōu)化濃度氯化鈉,分別在18℃、20℃、22℃、24℃、26℃孵育10 min;室溫、12 000 r/min離心5 min,沉淀蛋白用PBS重懸,各取10 μL進行SDS-PAGE分析。最后用優(yōu)化相變循環(huán)條件進行ELP-Fh8-P128融合蛋白純化。

1.6 標(biāo)簽切除與P128蛋白回收 按照文獻[8]用ELK16-TEVp活性包涵體切割ELP-Fh8-P128融合蛋白,ELK16-TEVp濃度為60 μg/mL,ELP-Fh8-P128融合蛋白濃度為200 μg/mL,反應(yīng)體系為100 μL,30℃孵育過夜;反應(yīng)結(jié)束后,12 000 r/min(4℃)離心10 min,去除 ELK16-TEVp活性包涵體,收集離心上清,用優(yōu)化相變循環(huán)條件去除ELPFh8標(biāo)簽。

1.7 蛋白分析 在融合蛋白純化、標(biāo)簽切除和P128蛋白回收各步驟,各取10 μL蛋白樣品進行12%SDS-PAGE分離,考馬斯藍染色后,用 Gel-DocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)進行蛋白條帶灰度掃描,以已知濃度蛋白Marker為參考,計算目的蛋白濃度、純度和產(chǎn)量。

1.8 最小抑(殺)菌濃度測定 參考文獻[5]分別測定P128蛋白對42株致奶牛乳房炎葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC),其中金黃色葡萄球菌10株(頭孢西丁耐藥3株),7種凝固酶陰性葡萄球菌32株(頭孢西丁耐藥4株)。

2 結(jié)果

2.1 P128蛋白編碼序列擴增 以pP128-SPMELP載體為模板,經(jīng)過35次循環(huán)PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示,擴增產(chǎn)物為預(yù)期的770 bp。將PCR產(chǎn)物克隆入pMD19-Simple載體,序列測定結(jié)果顯示與原序列相比無突變。

2.2 表達載體構(gòu)建 用限制酶SalI和XhoI將P128蛋白編碼序列從pMD19-Simple載體上切下,插入pELP-Fh8載體,獲得重組載體pELP-Fh8-P128,酶切鑒定結(jié)果顯示能切出770 bp插入片段。

2.3 融合蛋白表達 先將pELP-Fh8-P128重組菌在37℃、0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達6 h,SDSPAGE分析結(jié)果顯示,IPTG誘導(dǎo)重組菌出現(xiàn)預(yù)期的79 kDa額外蛋白條帶,表達產(chǎn)物存在于裂解菌體離心上清(圖 1)。 分別用 0.05、0.1、0.2、0.4、06、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組菌表達,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,0.1 mmol/L IPTG足以誘導(dǎo)ELPFh8-P128融合蛋白表達。最后將pELP-Fh8-P128重組菌在37℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達2、4、6、8、10 h,SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示誘導(dǎo) 6 h融合蛋白表達量最高。

圖1 ELP-Fh8-P128融合蛋白表達的SDS-PAGE分析

2.4 融合蛋白純化 沉淀ELP-Fh8-P128融合蛋白的最佳氯化鈉濃度為2.0 mol/L,最佳溫度為24℃。在優(yōu)化條件下進行融合蛋白純化,SDSPAGE分析結(jié)果顯示。初次相變循環(huán)純化融合蛋白純度為78%,再次相變循環(huán)純化融合蛋白純度為90%,產(chǎn)量為400 mg/L細菌培養(yǎng)(圖2)。

2.5 標(biāo)簽切除與P128蛋白回收 在優(yōu)化條件下用ELK16-TEVp活性包涵體切割ELP-Fh8-P128融合蛋白,反應(yīng)結(jié)束后離心去除ELK16-TEVp活性包涵體,再用相變循環(huán)沉淀 ELP-Fh8標(biāo)簽,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,回收獲得的重組P128蛋白純度為98%(圖3)。

圖2 ELP-Fh8-P128融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

圖3 重組P128蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.6 重組P128蛋白抑菌活性特異性檢測 取金黃色葡萄球菌和沙門菌各3株進行MIC測定,結(jié)果顯示P128蛋白對金黃色葡萄球菌的MIC為0.47 μg/mL,對沙門菌無抑菌作用。

2.7 重組P128蛋白對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC測定 選擇3株頭孢西丁耐藥和8株頭孢西丁敏感金黃色葡萄球菌進行MIC和MBC測定,結(jié)果顯示,除對1株頭孢西丁耐藥金黃色葡萄球菌無抗菌活性外,重組P128蛋白對其余金黃色葡萄球菌MIC在 0.23～1.88 μg/mL之間,MBC在0.94～15 μg/mL之間,對頭孢西丁耐藥和敏感金黃葡萄球菌抗菌活性無明顯差異(表1)。

表1 重組P128蛋白對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC測定

2.8 重組P128蛋白對凝固酶陰性葡萄球菌MIC和MBC測定 分別取7種25株凝固酶陰性葡萄球菌進行MIC和MBC測定,結(jié)果顯示：重組P128蛋白除對1株頭孢西丁耐藥沃氏葡萄球菌無抗菌活性,對其余凝固酶陰性葡萄球菌的MIC在0.12～1.88 μg/mL之間,MBC在0.94～15 μg/mL之間(表2)。

表2 重組P128蛋白對凝固酶陰性葡萄球菌的MIC和MBC測定

3 討論

本研究將P128蛋白與ELP、Fh8進行融合表達,其中ELP具有溫度敏感的可逆相變特性,在低于相變溫度溶液中呈可溶狀態(tài),在高于相變溫度時呈凝聚狀態(tài),因此ELP融合蛋白可用溫控離心法純化[8]。肝片吸蟲鈣結(jié)合蛋白Fh8為促溶標(biāo)簽[9],用以增強ELP融合蛋白的可溶性,因為其純化前提必須是可溶性蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,37℃表達的ELP-Fh8-P128為可溶性蛋白,可能與P128蛋白自身可溶性以及Fh8促溶標(biāo)簽有關(guān)。在優(yōu)化條件下進行兩次相變循環(huán),獲得的ELP-Fh8-P128融合蛋白純度高達98%,進一步證明ELP是非常有效的非親和純化標(biāo)簽。

本課題組曾用ELP/SPM表達與純化系統(tǒng)獲得了重組P128蛋白,但后繼試驗發(fā)現(xiàn)SPM自裂解重復(fù)性較差、重組P128蛋白回收率較低。TEVp不僅切割活性高、影響因素少,而且可與ELK16自聚肽融合以活性包涵體表達[6]。本研究利用TEVp活性包涵體切割ELP-Fh8-P128融合蛋白,結(jié)果顯示,切割效率接近100%,進一步證明TEVp活性包涵體具有很強的酶切活性。

研究資料顯示,重組P128蛋白對人源金黃色葡萄球菌具有很強的溶(殺)菌作用,包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[3],但對動物源葡萄球菌的溶(殺)菌作用尚無研究報道。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是多重耐藥葡萄球菌的代表[2],可用甲氧西林或頭孢西丁測定。為了探索用P128蛋白治療葡萄球菌性奶牛乳房炎可行性,本研究在測得葡萄球菌甲氧西林敏感性基礎(chǔ)上,分別測試了重組P128蛋白對甲氧西林敏感或耐藥葡萄球菌的MIC和MBC,結(jié)果顯示,盡管個別甲氧西林耐藥菌株對P128蛋白不敏感,但多數(shù)菌株對P128蛋白非常敏感,在甲氧西林耐藥與敏感菌株之間以及金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌之間無明顯差異。這些研究結(jié)果提示,重組P128蛋白不僅可用于各種葡萄球菌性奶牛乳房炎治療,還可用于多重耐藥葡萄球菌性奶牛乳房炎治療,具有良好的應(yīng)用前景。