孟旭英，李珍瑾，郭劍超

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科,天津 300211）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最嚴(yán)重腫瘤之一，排在十大常見腫瘤的第9位，幾乎可以發(fā)生在任何年齡，兒童中也時(shí)有發(fā)生[1]。年齡越大，膀胱癌的發(fā)病率也越高，以50～70歲為最高，其中男性發(fā)病率高于女性3～4倍，在三大泌尿系腫瘤疾病中，中國(guó)人群發(fā)病率最高[2]。隨著科技的發(fā)展，技術(shù)的提高，多數(shù)膀胱癌可以得到準(zhǔn)確的診斷和有針對(duì)性的治療，然而，隨之而來(lái)，診斷和治療的局限性也日趨凸顯，需要新的理念以及治療方法來(lái)改善。EZH2屬于核心酶PRC2的一個(gè)亞基，通過(guò)對(duì)組蛋白H3的第27位賴氨酸進(jìn)行三甲基化，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄沉默[3-6]。相關(guān)證據(jù)表明EZH2的甲基化功能不僅僅是主要的表觀遺

傳阻遏物，而且通過(guò)不同途徑激活基因表達(dá)在表觀遺傳學(xué)癌癥的治療中也具有臨床意義[7]，目前許多可以專門抑制EZH2酶活性的小分子抑制劑已經(jīng)開發(fā)出來(lái)[8-9]。組蛋白甲基化修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)以及流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡法研究組蛋白甲基化酶EZH2的特異性抑制劑與針對(duì)DNA的化療藥物絲裂霉素C(MMC)的單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞株功能的影響，探討該抑制劑與藥物聯(lián)合使用以及應(yīng)用于臨床的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。鼠源β-actin單克隆抗體、兔源EZH2單克隆抗體、兔源H3單克隆抗體、兔源H3K27me3單克隆抗體（密理博有限公司）、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（美國(guó)Cell signing公司），胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司），SYBR?Green Master Mix（諾唯贊生物科技有限公司），高糖DMEM培養(yǎng)基（上海玉博生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司），ECL發(fā)光液（碧云天生物技術(shù)有限公司），EZH2特異性抑制劑UNC1999（美國(guó)Selleck Chemicals公司），絲裂霉素C（日本KyowaHakko公司）。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥方法 T24細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)以及傳代。給藥時(shí)保證UNC1999 的終濃度為 10 μmol/L，作用 48 h；MMC的終濃度 為 0．1 mg/L，作用 48 h。

1．2．2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)EZH2的表達(dá) 分為（1） 對(duì)照組；（2）MMC 組；（3）UNC1999 組；（4）MMC+UNC1999組。各組分別用藥物處理，到達(dá)時(shí)間后收集細(xì)胞，Trizol法提取總的RNA，之后取出1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，Q-PCR法擴(kuò)增cDNA片段，序列如下：EZH2 上游 5′gttggcggaagcgtgtaaagactin 3′，下游5′gtatccttcgctgcttccattc3′；β -actin 上 游 5′TTGCTGACAGGATGCAGAAG 3′，下游 5′ATCCACATCTGCTGGAAGGT 3′。Q-PCR 反應(yīng)體系：Mix 10 μL，primer F 0．4 μL，primer R 0．4 μL，Rox 0．4 μL，CDNA 2μL，ddH2O6．8μL。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃15s，60℃ 1 min，共循環(huán) 40次，95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

1．2．3 Western blot檢測(cè) EZH2 以及 H3K27me3 蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)不同的藥物處理方案處理，胰酶消化，收集細(xì)胞于1．5 mL離心管中，1 200 r/min離心5min，棄上清，加入1mLPBS清洗2次，1200r/min離心5 min，棄去上清，加入RIPA裂解液，漩渦震蕩,充分混勻，冰浴30min，4℃，12000r/min，離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到1．5 mL離心管中，BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。加入6×Lodding buffer，混勻，100℃，煮沸5 min，保證蛋白質(zhì)充分變性。配置聚丙烯酰胺凝膠，按定量的結(jié)果，取50 μg上樣量，80 V待Marker分開，接著120 V至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，轉(zhuǎn)膜，300 mA 1．5 h，之后用含 5%脫脂牛奶的TBST封閉 2 h，兔單抗 EZH2（1∶2 000），H3K27me3（1∶1 000），H3（1∶3 000），鼠單抗 β-actin（1∶1 000），4℃過(guò)夜，之后用TBST于搖床上洗3次，每次5 min，羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶3 000） 室溫孵育 1．5 h，用TBST洗3次，每次5 min，ECl化學(xué)發(fā)光液顯色，Tanon 4500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀掃描。

1．2．4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 正常培養(yǎng)的T24細(xì)胞，待細(xì)胞密度匯集到80%以上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，調(diào)整濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板,每孔150 μL，待細(xì)胞貼壁良好后,開始稀釋藥品，按照之前的分組與給藥方式處理細(xì)胞。另外正常組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照,不加細(xì)胞的培養(yǎng)液作空白對(duì)照。各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。MTT法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒作用,藥物作用完成后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，再培養(yǎng)3 h，期間觀察，之后小心用移液槍吸棄培養(yǎng)液，于每孔加150 μL的DMSO，酶標(biāo)儀選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,用空白對(duì)照調(diào)零。計(jì)算細(xì)胞抑制率（%）。

1．2．5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，相同的濃度接種于6孔板中，按照方案用藥物處理，待作用時(shí)間到達(dá)后方可棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，棄去，加入相同的無(wú)藥物的培養(yǎng)，接著用10 μL槍頭在6孔板孔中部劃線，待48 h后進(jìn)行拍攝，比較各組細(xì)胞的遷移情況。

1．2．6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照分組接種于6孔板中，分別用藥物處理，到達(dá)時(shí)間后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，取3×105個(gè)細(xì)胞，加入195 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，之后加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻，常溫避光孵育10 min，離心，棄上清。加入200 μL結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入20 μL PI混勻，將樣品用錫紙包裹，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 Q-PCR法檢測(cè)EZH2基因的表達(dá)量 結(jié)果見圖1。UNC1999組、絲裂霉素C組與對(duì)照組相比EZH2表達(dá)水平明顯下調(diào)，而UNC1999和MMC組為最低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001、P＜0．01），說(shuō)明MMC以及UNC1999均引起EZH2表達(dá)水平的下調(diào)。

圖1 各組EZH2基因表達(dá)比例柱形圖Fig 1 Comparison of the expression levels of EZH2 gene in each treatment group

2．2 Western法檢測(cè)EZH2以及下游H3K27me3蛋白的表達(dá)水平 結(jié)果見圖2。UNC1999以及絲裂霉素C單獨(dú)作用于T24細(xì)胞均引起EZH2蛋白水平的降低，而兩者聯(lián)合作用為最低，同時(shí)下游H3K27me3表達(dá)水平與EZH2改變相同。

圖2 各處理組EZH2蛋白表達(dá)水平(A)以及H3K27me3蛋白表達(dá)水平(B)Fig 2 EZH2 protein expression level(A)and H3K27me3 protein expression level(B)

2．3 MTT法檢測(cè)4組T24細(xì)胞的增殖能力 圖3示，UNC1999抑制劑組以及絲裂霉素C組與對(duì)照組相比，T24細(xì)胞的增殖能力均降低，而兩者聯(lián)合作用為最低，此結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001，P＜0．01）。

圖3 各處理組T24細(xì)胞增殖比例柱形圖Fig 3 ProliferationratioofT24cellsineachtreatmentgroup

2．4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4組T24細(xì)胞的遷移 圖4示，UNC1999以及絲裂霉素C單獨(dú)作用于T24細(xì)胞均引起T24細(xì)胞遷移能力的下降，而兩者聯(lián)合作用為最低，此結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 藥物處理后4組細(xì)胞的遷移情況Fig 4 Migration of four groups after drug treatments

2．5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 圖 5示，UNC1999以及絲裂霉素C單獨(dú)作用于T24細(xì)胞均引起T24細(xì)胞的凋亡水平上調(diào)，而兩者聯(lián)合作用為最大。

圖5 藥物處理后4組細(xì)胞的凋亡水平Fig 5 Apoptosis of four groups after drug treatments

3 討論

人類癌癥基因組測(cè)序顯示編碼染色質(zhì)的各種組蛋白修飾基因的變異與癌癥[11-13]的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近些年發(fā)現(xiàn)的證據(jù)表明組蛋白甲基化修飾基因EZH2與許多癌癥存在密切關(guān)系[14-18]。EZH2是主要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能對(duì)組蛋白第27位賴氨酸進(jìn)行三甲基化，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，其中包括前列腺，肺和膀胱癌。它不僅與癌細(xì)胞增殖相關(guān)，同時(shí)與癌細(xì)胞干細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。另外，EZH2也參與了前列腺癌和乳腺癌的發(fā)展，可以作為侵略性癌癥類型的標(biāo)志物預(yù)測(cè)臨床結(jié)果[19]。EZH2轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)促進(jìn)乳腺腫瘤病毒引起腫瘤的發(fā)生[20]。除此之外，胰腺以及乳腺癌干細(xì)胞的維持也需要EZH2表達(dá)[21]。因此，EZH2是一種有希望的癌癥治療靶點(diǎn)。

MMC屬于針對(duì)膀胱癌的主要的化療藥物之一[22]，屬于細(xì)胞周期的非特異性藥物,主要作用部位位于細(xì)胞核,通過(guò)破壞DNA的結(jié)構(gòu)與功能來(lái)抑制或殺滅癌細(xì)胞。從理論上來(lái)說(shuō)，單一用藥對(duì)于清除由異源細(xì)胞群體發(fā)育而來(lái)的腫瘤塊難度很大[23]，而且單一用藥會(huì)引起藥物毒性,特別在大劑量的應(yīng)用時(shí)負(fù)面情況更加明顯。

當(dāng)前，對(duì)于膀胱癌的治療主要采用單一的化療藥物處理，治療難度大，后期容易引起毒性，目前研究組蛋白甲基化修飾與相應(yīng)的癌癥的發(fā)生發(fā)展是研究的熱點(diǎn)，但是關(guān)于組蛋白甲基化修飾基因抑制劑與膀胱癌化療藥物聯(lián)合使用的相關(guān)研究比較少，在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)采用EZH2的特異性抑制劑UNC1999以及化療藥物MMC處理T24膀胱癌細(xì)胞，探討單獨(dú)用藥以及聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的增殖遷移以及凋亡能力的影響，不單從基因角度闡明甲基化修飾對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的重要性，也將特異性的組蛋白甲基化修飾基因EZH2的小分子抑制劑與抗癌藥物的使用聯(lián)合起來(lái)，評(píng)估二者聯(lián)合使用以及單獨(dú)使用的效果，為后面針對(duì)膀胱癌治療的用藥方案提供參考。

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