翁宏飚，牛寶龍

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蠶桑所，浙江 杭州 310021）

自從上世紀(jì)三十年代發(fā)現(xiàn)蠶卵在一定條件下，可少量發(fā)生孤雌發(fā)育的現(xiàn)象以來(lái)，人們開(kāi)展了大量的家蠶未受精卵的孤雌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，篩選易發(fā)品系，建立起高效的家蠶孤雌生殖體系［1～3］。在國(guó)內(nèi)，對(duì)家蠶種質(zhì)庫(kù)中的保存品種進(jìn)行篩選，并通過(guò)連續(xù)多代的選擇，建立起全球最大的家蠶孤雌生殖種質(zhì)資源庫(kù)，培育的孤雌生殖家蠶品種進(jìn)入生產(chǎn)實(shí)用［4］。在開(kāi)展家蠶孤雌生殖應(yīng)用研究的同時(shí)，家蠶孤雌生殖機(jī)理的研究也在不斷探索中。通過(guò)家蠶孤雌生殖發(fā)育蠶卵的細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)46℃、18 min的熱激處理，可以使阻滯于第一次減數(shù)分裂的染色體結(jié)構(gòu)解體，同源染色體不再分離，直接進(jìn)入第二次減數(shù)分裂模式，染色單體相互分離，從而使得子代染色體組保持與親代相同的2 n［2］。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在家蠶嵌合體突變品系的孤雌生殖中，同時(shí)存在極體自受精和不完全減數(shù)分裂兩種機(jī)制，而在可自發(fā)發(fā)生孤雌生殖的品系M90中，其孤雌生殖發(fā)育則主要為不完全減數(shù)分裂機(jī)制［5］。孤雌生殖品系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果顯示，許多調(diào)控途徑參與了家蠶熱激誘導(dǎo)的孤雌生殖發(fā)育［6］。

卵母細(xì)胞成熟調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的多因子調(diào)節(jié)過(guò)程。在脊椎動(dòng)物中，卵細(xì)胞分裂阻滯于第2次成熟分裂中期，等待受精活化［7］。而在無(wú)脊椎動(dòng)物中，卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的第2次分裂阻滯發(fā)生在第1次成熟分裂中期［8］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activat?ed protein kinase cascade，MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要通路，參與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)［9］。MAPK在卵細(xì)胞減數(shù)分裂的MⅠ期/MⅡ期轉(zhuǎn)變過(guò)程中保持活性，是調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的中樞［10］。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)途徑參與脊椎動(dòng)物卵細(xì)胞的人工活化過(guò)程［11～12］，在卵受精或孤雌活化后，MAPK發(fā)生去磷酸化而失活，分裂阻滯解除，細(xì)胞恢復(fù)分裂。在對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物葉蜂的研究中發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)途徑參與葉蜂的孤雌生殖發(fā)育，蜂卵經(jīng)人工孤雌激活，分裂阻滯解除后，隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化修飾的MAPK和MEK含量逐漸下降，激活后50 min，已檢測(cè)不到磷酸化修飾的激酶［13］。定量比較MAPK信號(hào)通路基因在有性生殖品系與孤雌生殖品系間的表達(dá)差異，結(jié)果顯示信號(hào)通路基因的表達(dá)，在兩個(gè)品系間存在顯著性差異，暗示MAPK信號(hào)通路可能參與了家蠶孤雌生殖發(fā)育［14］。

MAPK信號(hào)通路的核心是幾種蛋白激酶的順序磷酸化激活，MEK是催化MAPK磷酸化修飾的直接分子［15］。U0126是MEK1/2的高效特異性抑制劑。對(duì)葉蜂卵的研究中發(fā)現(xiàn)，以抑制劑U0126處理蜂卵，可以降低卵內(nèi)MAPK的磷酸化水平，解除卵細(xì)胞分裂阻滯，誘導(dǎo)恢復(fù)分裂，達(dá)到孤雌誘導(dǎo)的效果［13］。家蠶孤雌生殖首先需要通過(guò)熱激處理，解除細(xì)胞分裂阻滯，恢復(fù)細(xì)胞分裂過(guò)程，而后在各種機(jī)制的維護(hù)下完成胚胎發(fā)育。本研究以不同濃度的U0126注射羽化前不同時(shí)期的雌蛹，羽化后收集未受精卵，46℃、18 min熱激誘導(dǎo)孤雌生殖，調(diào)查未受精卵的轉(zhuǎn)色率、孵化率指標(biāo)，結(jié)果顯示U0126可以促進(jìn)未受精卵孤雌生殖激活后早期胚胎的發(fā)育，提高蠶卵的轉(zhuǎn)色率。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

家蠶孤雌生殖品系無(wú)14是原種54A，經(jīng)連續(xù)多代熱激（46℃，18 min）誘導(dǎo)篩選出的PL品系；多化性品系Nastari為浙江省農(nóng)科院蠶桑所保存蠶品種。

抑制劑U0126購(gòu)自Selleck公司（美國(guó)），溶劑DMSO購(gòu)自上海生工，未受精卵熱激用水浴、恒溫恒濕箱購(gòu)自上海博訊公司；protoCOL自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（synbiosis，Cambridge，UK）為農(nóng)科院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所儀器。

1.2 方法

將U0126粉劑溶于DMSO，配制成10 mmol母液，于-20℃分管保存。使用時(shí)用PBS緩沖液稀釋成工作液備用。

熟蠶上蔟結(jié)繭后，削繭鑒蛹，雌蛹常規(guī)保護(hù)至復(fù)眼著色。取10 g消特靈粉劑溶于2 L蒸餾水中，配制成蛹體消毒液。將復(fù)眼著色雌蛹浸入消毒液中1 min，撈出后放在干凈的吸水紙上晾干保護(hù)。在羽化前2 d，按每蛹20 μL的注射量，給雌蛹注射U0126工作液并常規(guī)保護(hù)至羽化，每個(gè)濃度注射10顆雌蛹。蠶卵孤雌生殖誘導(dǎo)及蠶卵保護(hù)參照［4］方法進(jìn)行。由于無(wú)14品系孤雌生殖發(fā)育良好，蠶卵發(fā)育調(diào)查時(shí)，隨機(jī)稱取0.1克蠶卵，統(tǒng)計(jì)良卵率和孵化率；多化性品系Nastari蠶卵發(fā)育初期不著色，在孵化前2～3 d開(kāi)始轉(zhuǎn)色。考慮到Nastari孤雌生殖蠶卵的發(fā)育較有性生殖蠶卵慢，因此在有性生殖蠶卵孵化后一周，隨機(jī)稱取0.15 g蠶卵，均勻攤于8 mm平皿中，用菌落計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)色蠶卵數(shù)，并計(jì)算單位重量的轉(zhuǎn)色蠶卵數(shù)量，用于統(tǒng)計(jì)分析。儀器的設(shè)置為：曝光時(shí)間：40 ms；排除小顆粒：小于0.1 mm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

圖1 U0126處理后孤雌生殖品系無(wú)14良卵率和孵化率Figure 1 Good egg rate and hatching rateof Wu14with U0126treating

2 結(jié)果與分析

2.1 品系無(wú)14的孤雌生殖激活

2017年春蠶期，無(wú)14上蔟結(jié)繭后，于6月3日注射雌蛹，6月5日羽化，常規(guī)取卵，孤雌生殖誘導(dǎo)，蠶卵保護(hù)及入庫(kù)冷藏，8月15出庫(kù)調(diào)查并開(kāi)始催青。蠶卵調(diào)查結(jié)果如圖1。

抑制劑U0126處理孤雌生殖品系無(wú)14后，高濃度組的良卵率指標(biāo)與對(duì)照組的相仿，但低濃度組及有機(jī)溶劑DMSO組的良卵率顯著下降。蠶卵孵化率指標(biāo)，對(duì)照組與高濃度組無(wú)統(tǒng)計(jì)差別，而低濃度組及溶劑組則極顯著降低。

2.2 品系Nistari的孤雌生殖激活

2017年秋蠶期，于9月13日注射處理Nistari雌蛹，9月15日羽化，收集未受精卵并進(jìn)行孤雌生殖熱激誘導(dǎo)，因Nastari品系孤雌生殖孵化率極低，而且蠶卵早期不著色，為判斷發(fā)育進(jìn)度，設(shè)置有性生殖蠶卵對(duì)照，同步蠶卵保護(hù)及催青，有性生殖蠶卵孵化后一周，用自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀調(diào)查孤雌生殖的發(fā)生情況。結(jié)果如圖2。

雖然Nistari經(jīng)U0126處理后，各處理組均無(wú)孵化，但各組的蠶卵轉(zhuǎn)色情況并不相同。20 μmol/L處理組蠶卵轉(zhuǎn)色極顯著優(yōu)于其他處理組；10 μmol/L處理組極顯著好于5 μmol/L組和對(duì)照組；5 μmol/L組和對(duì)照組的單位卵重轉(zhuǎn)色卵數(shù)則極顯著高于溶劑對(duì)照組和1 μmol/L處理組。

3 討論

目前家蠶孤雌生殖發(fā)育的調(diào)查指標(biāo)主要有蠶卵著色率（孤雌生殖發(fā)生率）及催青后孵化率。普通蠶品種在受精或孤雌生殖激活后，細(xì)胞恢復(fù)分裂并開(kāi)始胚胎發(fā)育約24 h～28 h，卵內(nèi)漿膜形成后轉(zhuǎn)為固有色，再經(jīng)10 d左右催青而后孵化?，F(xiàn)有蠶品種經(jīng)熱激誘導(dǎo)后，有較高的未受精卵著色率，平均蠶卵著色率為50%左右［4，16-17］，部分蠶卵能發(fā)育到轉(zhuǎn)青期和點(diǎn)青期，但極少孵化。本實(shí)驗(yàn)所用的Nistari是多化性熱帶白卵蠶品種，蠶卵激活開(kāi)始發(fā)育后，早期蠶卵不轉(zhuǎn)色，催青第7 d-8 d左右，蠶卵出現(xiàn)少量著色，在有性生殖蠶卵孵化后5 d內(nèi)，孤雌生殖蠶卵顏色仍在變化，7 d后蠶卵顏色變化不大。因此，實(shí)驗(yàn)中在有性生殖蠶卵孵化后第7 d，調(diào)查孤雌生殖蠶卵的轉(zhuǎn)色情況，作為Nistari孤雌生殖發(fā)育的指標(biāo)。

圖2 U0126處理后，每克孤雌生殖蠶卵中的著色卵數(shù)Figure 2 Amount of coloring eggs in each gram of parthenogenesis eggs with U0126 treating

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)高、中濃度抑制劑處理后，Nistari品系的轉(zhuǎn)色卵比例極顯著高于對(duì)照。已有的研究顯示，家蠶的遺腹卵率大約在10%～15%左右［18］，雖然遺腹卵不等同于未成熟卵，但不能排除大部分遺腹卵屬于未成熟卵，孤雌生殖誘導(dǎo)后不能著色而成為不良卵。考慮到用于孤雌生殖誘導(dǎo)的未受精卵為解剖卵，包含了全部未成熟卵，因此抑制劑處理后無(wú)14良卵率的提高雖未達(dá)顯著水平，但可以確定U0126處理可以使得更多蠶卵被激活而進(jìn)入胚胎發(fā)育，或有利于孤雌生殖蠶卵的發(fā)育。Nistari低濃度組和溶劑組的轉(zhuǎn)色卵指標(biāo)極顯著低于對(duì)照組，以及無(wú)14低濃度組和溶劑組的良卵率顯著低于對(duì)照組，可能是由于DMSO的細(xì)胞毒性，抑制了胚胎發(fā)育造成的。而且DMSO的細(xì)胞毒性在無(wú)14孵化率上也有體現(xiàn)：在低濃度組和溶劑組中，無(wú)14的孵化率極顯著地低于對(duì)照組。另外，Nistari品系的不滯育和卵發(fā)育后期轉(zhuǎn)色的特點(diǎn)，是合適的家蠶孤雌生殖研究材料。

顯微觀察孤雌生殖轉(zhuǎn)色卵，可見(jiàn)蠶卵呈現(xiàn)塊狀或帶狀著色斑，而不是有性生殖蠶卵的完全著色形式，因此在統(tǒng)計(jì)著色卵指標(biāo)時(shí)，可能因統(tǒng)計(jì)人員的不同，而出現(xiàn)不同的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，影響結(jié)果分析。本研究中，利用自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，通過(guò)設(shè)置合適的參數(shù)，可以客觀、高效地統(tǒng)計(jì)著色卵數(shù)，因而該系統(tǒng)可以在家蠶孤雌生殖研究中應(yīng)用。

［1］ ASTAUROV B L.Artificial parthenogenesis and experi?mental polyploidy in silkworm［J］.The Journal of Sericul?tural Science of Japan，1967，36：277-285.

［2］ STRUNNIKOV V A.Control over Reproduction，Sex，and Heterosis of the silkworm［M］.London：Harwood Academ?ic Publishers，1995.

［3］ KLYMENKO V V.Parhenogenesis and cloning in the silkwormBombyx mori L：Problem and prospects［J］.J.In?sectBiotech.Sericol，2001，70：155-165.

［4］ 王永強(qiáng)，徐孟奎，何秀玲，等.家蠶現(xiàn)行品種孤雌生殖的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2001，27（1）：20-23.

［5］ KUSAKABE T，KIDO K，KITA K，et al.Analysis of artifi?cial andspontaneousparthenogenetic development in mosa?ic mutationsand the parthenogenetic strain of Bombyx mo?ri［J］.Invertebrate Reproduction&Development，2004，45（2）：101-108.

［6］ LIU P，WANG Y，DU X，et al.Transcriptome Analysis of Thermal Parthenogenesis of the Domesticated Silkworm［J］.2015，PLOS ONE DOI：10.1371/journal.pone.0135215.

［7］ MCCARTER J，BARTLETT B，DANG T，et al.On the control of oocyte meiotic maturation and ovulation in Cae?norhabditis elegans［J］.Developmental Biology，1999，205（1）：111-128.

［8］ MASUI Y.Meiotic arrest in animal oocytes［M］.San Di?ego：Academic Press，1985.

［9］ SUN Q Y，BREITBRTH，SCHATTEN H.Role of the MAPK cascade in mammalian germ cells［J］.Reproduc?tion，F(xiàn)ertility，and Development，1999，11（8）：443-450.

［10］DUPRé A，HACCARD O，JESSUS C.Mos in the Oocyte：How to Use MAPK Independently of Growth Factors and Transcription to Control Meiotic Divisions［J］.Journal of Signal Transduction，2011，2011（2090-1739）：350412.

［11］FAN H Y，SUN Q Y.Involvement of mitogen-activated protein kinase cascade during oocyte maturation and fer?tilization in mammals［J］.Biology of Reproduction，2004，70（3）：535-547.

［12］吳曉慧，李衛(wèi)平，狄文.卵母細(xì)胞減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變過(guò)程的調(diào)控機(jī)制［J］.生殖與避孕，2009，29（11）：741-745.

［13］DAISUKE S Y，KAZUNORI T，MEGUMI S，et al.Involve?ment of Mos–MEK–MAPK pathway in cytostatic factor（CSF） arrest in eggs of the parthenogenetic insect，Athalia rosae［J］.Mechanisms of development，2008，125：996-1008.

［14］翁宏飚，劉培剛，牛寶龍，等.MAPK信號(hào)通路參與熱激誘導(dǎo)家蠶未受精卵發(fā)生孤雌生殖發(fā)育的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2016，42（4）：0598-0605.

［15］范衡宇，佟超，陳大元，等.MAPK信號(hào)通路在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用［J］.科學(xué)通報(bào)，2002，47（9）：650-656.

［16］潘少茜，李寶瑜，廖瓊香，等.家蠶資源品種孤雌生殖力的研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，1996（3）：40-42.

［17］白興榮，廖鵬飛，邵榆嵐，等.云南省部分家蠶品種資源的孤雌生殖發(fā)生率調(diào)查［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（5）：0938-0941.

［18］嚴(yán)會(huì)超，林健榮，鐘生泉，等.家蠶遺腹卵的研究-Ⅰ.環(huán)境條件與家蠶遺腹卵發(fā)生的關(guān)系［J］.廣東蠶業(yè)，1997，31（2）：22-26.