錢 坤，劉 迪，徐國文

（1.湖州師范學(xué)院，浙江 湖州 313000； 2.浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.湖州新天絲生物技術(shù)有限公司，浙江 湖州 313000）

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)紡織纖維材料之一，享有“纖維皇后”之美譽。具有良好的吸濕性和優(yōu)雅的光澤，絲綢服裝穿著舒適、優(yōu)美、典雅，對人體有良好的保健功能，深受國內(nèi)外消費者喜愛。隨著對蠶絲結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，其開發(fā)利用的研究領(lǐng)域也不斷的拓寬，逐漸延伸到食品、發(fā)酵、生物制藥、工業(yè)新材料、醫(yī)用材料及化妝品等領(lǐng)域，并呈現(xiàn)出蓬勃發(fā)展的態(tài)勢。蠶絲蛋白在食品、新型保健品的應(yīng)用更是雨后春筍般的發(fā)展。絲素肽作為小分子肽更容易被人體吸收，更適合在保健食品上的開發(fā)與應(yīng)用［1～3］。絲素是一種天然的大分子纖維蛋白質(zhì)，分子量在30萬±0.5萬道爾頓。用生物化學(xué)工程法精加工成分子量500～5000（d）的可溶性絲素肽，可作為食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品工業(yè)的特殊營養(yǎng)添加劑［4］。制取絲素肽的原料可用繅絲、織綢中的下腳料，經(jīng)脫膠凈化等加工成純絲素。蠶絲纖維的主要成分是絲膠和絲素，另外還有少量的蠟質(zhì)層，碳水化合物，色素，無機(jī)成分，一般蠶絲含絲素70%～80%，絲膠25%左右，其它物質(zhì)2.5%左右。（繭衣中絲膠含量有40%～42%絲素含量相對較低），絲素蛋白屬于硬蛋白，與皮膚表層，毛發(fā)角蛋白屬同一大類，絲素蛋白的分子量最大達(dá)30萬±0.5萬道爾頓。絲素為纖維狀結(jié)構(gòu)，每根繭絲由兩種平行單絲黏合而成，每根單絲中間為絲素纖維，外為絲膠，絲素纖維的斷面積平均為80μ2，每根絲素纖維由50～100根細(xì)纖維經(jīng)絲膠黏合而成。細(xì)纖維又由徑為10μ的微纖維組成，而微纖維由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成［5］。

絲素蛋白中的各種氨基酸由肽鍵（-CONH-）聯(lián)結(jié)成肽鏈，再通過肽鍵、氫鍵、酯鍵、鹽鍵、二硫鍵等構(gòu)成蛋白質(zhì)。絲素纖維的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為結(jié)晶區(qū)、非結(jié)晶區(qū)，每個結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)都會有若干條肽鏈的鏈段，而每條肽鏈都要通過若干個結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，結(jié)晶區(qū)主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，比例大致為3∶2∶1，甘氨酸和丙氨酸總量占70以上，而非結(jié)晶區(qū)主要由酸性氨基酸、堿性氨基酸、脯氨酸、酪氨酸等組成［6］。根據(jù)絲素纖維蛋白的結(jié)構(gòu)特點，可以采用不同的方法，使高分子量的絲素，轉(zhuǎn)變成分子量較低可溶于水的多肽。在酸堿溶液、氯化鈣中性溶液中，由于H+、OH-、Ca2+、Cl-等極性離子的作用，水分子不僅進(jìn)入絲素的非結(jié)晶區(qū)，而且進(jìn)入結(jié)晶區(qū)，削弱了分子鏈間的范德華力，使絲素分子從緊密狀態(tài)變成疏松無序狀態(tài)，無限膨潤分解。分子量下降到10×102～10×102的多縮氨酸。絲素肽的分子構(gòu)象為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主，這使具有優(yōu)良的水溶性，可以在不添加任何乳化劑、分散劑情況下，按任意比例與其它水溶性原料摻和，同時又保持了平衡狀況下各類氨基酸。

現(xiàn)介紹將分子量在30萬±0.5萬、結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，一般情況下人體難于消化吸收的絲素轉(zhuǎn)變成由平均分子量為90的氨基酸及由5個至6個直至100個左右構(gòu)成的多肽類物質(zhì)，以及單一氨基酸的復(fù)合物，可以采用強酸、強堿、中性鹽和酶等降解劑予以消化。

1 中性鹽法制備絲素肽

按照氯化鈣∶水∶絲素＝1∶2∶5，即100 g絲素（干）200 g CaCl2（試劑級），500 m l水（純水）配方，先將CaCl2溶于水成溶液，加溫至沸110℃±2℃時，投絲素（105℃可投），100 min內(nèi)，在攪動情況下就會全部溶解，加入少量（1左右）純水，冷卻后，裝入透析袋透析。由于半透膜的鹽滲析作用，72 h內(nèi)，可將絕大部分Ca2+、Cl-帶走，而剩下絲肽蛋白此時的平均分子量一般為10000 D左右，此方法所得產(chǎn)品平均分子量較大，水溶性很好，色澤為純白色，可在塑袋真空裝下。

上述獲得的絲肽，再經(jīng)堿或酶降解，就可得平均分子量較低的絲肽，如表1、表2所示。

表1 不同濃度氫氧化鈉（0.05 N～0.1N）的堿解結(jié)果

表2 不同濃度氫氧化鈉（0.05N）的堿解結(jié)果

經(jīng)透析水解液用胰酶進(jìn)一步降解，那么絲肽的質(zhì)量更好。因為采用NaOH，必須用中和法除去，加了絲肽中鹽分的含量，往往使灰分達(dá)不到規(guī)定指標(biāo)。

胰酶的降解需掌握以下條件，當(dāng)絲素的中性鹽水解液，經(jīng)半透膜滲析除鹽72 h～90 h后，一般Ca2+Mg2+的含量在＜80 mgN/升氯根＜80 mgN/升，（2 mg～3 mg當(dāng)量）。灰分能達(dá)規(guī)定指標(biāo)要求。此時將透析液煮沸后，測總固含量，再按總固量加0.1%～0.5%的胰酶（先用氨水調(diào)水解液pH 7.5～8）。40℃±2℃下恒溫2 h～4 h不等。再升溫失活，加活性炭脫色（活性炭量視液體色澤而定，色淺也可不加活性炭）然后濃縮，噴粉，可得成品。

蠶絲蛋白在分解反應(yīng)過程中，由于酶的作用，微量氨基酸分子結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，即蠶絲蛋白中的微量丙氨酸（ɑNH丙酸）、絲氨酸（ɑOH丙酸）、胱氨酸（ɑNH?SH丙酸）的COOH等基團(tuán)產(chǎn)生了裂解轉(zhuǎn)位，從而會形成微量丙酸基團(tuán)。當(dāng)然，酶解濃度、時間的變化都會對裂解的效果產(chǎn)生影響。所產(chǎn)生的丙酸含量大約在10 mg/kg～100 mg/kg左右。

2 中性鹽-乙醇法制備絲素肽

有文獻(xiàn)［7～9］介紹采用CaCl2-C2H5OH溶液溶解絲素的方法，其比例為氯化鈣∶乙醇∶水＝1∶2∶8（M比，即摩爾比），而絲素與以上三元溶液的浴比為1∶50和1∶25。我們根據(jù)自己的經(jīng)驗，列出如下表（表3），再行選擇。

表3 采用三元溶液配方表（絲素浴比為1：8）

1 mol CaCl2為 146 g，1mol H2O 為 18 g，1 mol C2H5OH為46 g。取3號配方及1∶8浴比進(jìn)行實驗室試驗：取凈化毛絲絲素160g。氯化鈣=水∶乙醇=146∶144∶92=38.2%：37.7%∶24.1%。故此，需CaCl22H2O 160×8×38.2%=489 g，需H2O483g和乙醇308 g。由于乙醇為95%濃度，已含水23 g，所以實際需水460 g和乙醇331 g（95%含量）。以上配成三元溶液計1280 g，水浴加熱至70℃投入絲素，在70℃±2℃的條件下進(jìn)行水解，1.5 h左右溶解，再經(jīng)2h水解。水解時要裝乙醇回流裝置，防止乙醇濃度降低。然后扎帶用透析包透析，除鹽后過濾測總固，經(jīng)中科院上海昆蟲所采用凝膠電泳法檢測，其分子量峰值集中在48000 D～67000 D，以后再采用此法連續(xù)投料，得透析液，采用噴霧干燥，得白色絲肽粉。所以，采用以上工藝可以生產(chǎn)50000 D～70000 D高分子絲肽。

3 酸、堿水解法制備絲素肽

我們重點選用硫酸和氫氧化鋇、氫氧化鈣，因為硫酸鋇的溶解度極低，并且可以用離子交換732樹脂除去部分鈣、鎂離子，使成品的灰分降到標(biāo)準(zhǔn)以下。BaSO4在純水中，25℃時溶解度為1.04×10-5M（摩爾/升），或為2.8 mg/L，CaSO4在25 ℃時在純水中溶解度為7.8×10-3摩爾/L（1摩爾BaSO4171 g，1摩爾CaSO4136 g，171×1.04×10-5=0.0017784 g/L，136×7.810-3=1.0608 g/L）。如果在常溫下用硫酸或用氫氧化鋇相互中和后，在溶液中所含BaSO4的量為0.0018 mg/L，而含量為10%絲肽液1000 L，可噴100 kg粉，內(nèi)可能含BaSO4為0.0018×1000=1.8 g，只占1.8 g/100 kg，即十萬分之一點八克。而同樣用Ca（OH）2中和H2SO4，在常溫下溶液所含硫酸鈣的濃度為1.0608×1000=1061 g，即1.061 kg/100 kg。

這只是理論計算，在實際操作中，由于中和過濾溫度較高含量還會增加。

用鹽酸酸水解制備絲素肽的方法，例如，采用3 N～4 N鹽酸，按1∶3浴比對絲素進(jìn)行16 h～18 h水解，然后用減壓去酸辦法，除去部分鹽酸，再用堿中和至pH 5～7。但內(nèi)含氯化鈉量較多，雖用活性炭脫色，可得淡黃絲肽液，但含量較低，質(zhì)量較差，無法制成固體粉末。改用硫酸代替鹽酸用15%～22%硫酸，不完全水解絲素。經(jīng)過15 h～18 h，再用氫氧化鋇或氫氧化鈣中和除去硫酸，可得絲素肽液體，經(jīng)脫色過濾離子交換發(fā)脫灰生產(chǎn)液態(tài)絲素肽，或噴粉成固體。如將以上水解液測總固后，再用胰酶水解成分子量較低的絲素肽。

22%H2SO4回流水解22 h，然后用Ba（OH）28H2O中和至終點（pH 5.33～5.5）攪0.5 h，板框壓濾，濾液得淡黃色濾液，測含固（投111 kg凈干，得860 L脫色液，含固0.06033 g/ml，共得51.63 kg，Mn132）。采用732～717樹脂純化，去除重金屬，各0.5 h，即可得低分子量的絲肽。

總之，利用蠶絲絲素，經(jīng)生物化學(xué)法，精加工生產(chǎn)分子量為500 D～10000 D的系列絲素肽，作為食品、化妝品、醫(yī)藥材料的重要原料，從而可將廢蠶繭絲低值原料加工為高附加值產(chǎn)品。