劉開云， 劉 歡， 張 融， 馬愛寧

人β-防御素（HBD）是近些年來發(fā)現(xiàn)的一類 極為重要的內(nèi)源性抗微生物肽，其抗感染功能正逐漸被臨床所認(rèn)識[1]，被認(rèn)為是抵抗病原微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障[2-3]，HBD有HBD-1、HBD-2和HBD-3等亞型，其表達(dá)可能因感染類型和感染部位而異。雖然對HBD-1在各種感染性疾病中的研究日益深入，但對其在兒童感染性疾病中的研究甚少。兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）是小兒呼吸系統(tǒng)最常見的感染性疾病之一，通過對兒童CAP不同臨床類型外周血中HBD-1表達(dá)水平的研究，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 資料來源

2015年2－10月于我院兒科住院的CAP患兒共122例，均符合CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)熱、咳嗽、呼吸頻率增快、呼吸困難、胸壁吸氣性凹陷、肺部濕啰音和管狀呼吸音等，胸部X線片異常表現(xiàn)包括肺紋理增多增粗、肺部斑片狀模糊影、肺實(shí)變、肺不張、胸腔積液等，均符合兒童CAP臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征[4]為CAP組，其中男83例（68.0%），女39例（32.0%）。對照組52例，為同期本院兒外科因腹股溝疝、包莖、精索囊腫等非感染性疾病而擇期手術(shù)入院的患兒。其中男41例（78.8%），女11例（21.2%）。CAP組與對照組在性別及年齡上無差異。經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施，所有患兒的家屬均同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)檢查 所有CAP患兒入院后按診療常規(guī)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢查：病原學(xué)檢查、C反應(yīng)蛋白（CRP）、血常規(guī)及X線胸片（或胸部低通量CT）。根據(jù)病原學(xué)將CAP分組為病毒性肺炎41例，細(xì)菌性肺炎35例，肺炎支原體或肺炎衣原體肺炎46例。根據(jù)臨床表現(xiàn)將CAP分組為重度肺炎39例，普通肺炎83例。臨床表現(xiàn)為胸壁吸氣性凹陷、鼻翼扇動(dòng)、呻吟、中心性紫紺、嚴(yán)重呼吸窘迫、拒食或脫水癥、意識障礙之一者診斷為重度肺炎[4]，否則為輕度肺炎。CAP患兒按年齡段分：≤6月齡31例，＞6～12月齡32例，＞12～36月齡33例，＞36月齡26例。對照組患兒血清均來自術(shù)前常規(guī)檢查的標(biāo)本。所有患兒入院后將血清置于-80?℃保存，以備HBD-1檢測。

1.2.2 血清中HBD-1測定 使用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的HBD-1試劑盒，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測患兒血清中HBD-1水平，使用生化儀提取總蛋白，然后采用雙縮脲法測定，均在自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行， 每次測定均嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)控品的同步檢測。標(biāo)準(zhǔn)血清HBD-1濃度測定均嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及不同樣品的總蛋白濃度進(jìn)行歸一化處理后得到標(biāo)準(zhǔn)血清HBD-1蛋白濃度。

試驗(yàn)應(yīng)用雙抗體夾心法測定血清中HBD-1水平：準(zhǔn)備試劑、標(biāo)準(zhǔn)血清和標(biāo)準(zhǔn)品，加入準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)血清和標(biāo)準(zhǔn)品，37?℃反應(yīng)30 min；洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37?℃反應(yīng)30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37?℃顯色10 min；加入終止液，15 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（D值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)血清中人HBD-1濃度（μg/L）。

1.2.3 呼吸道病毒檢測 使用北京貝爾生物工程有限公司生產(chǎn)的系列呼吸道病毒檢測試劑盒，包括人呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、A型流感病毒、B型流感病毒IgM抗體檢測試劑盒，用ELISA體外定性檢測患兒血清中的呼吸道病毒IgM抗體。

1.2.4 肺炎支原體、肺炎衣原體抗體檢測 使用深圳市安群生物工程有限公司生產(chǎn)的肺炎支原體、肺炎衣原體IgM抗體檢測試劑盒，用ELISA定性檢測患兒血清中的肺炎支原體IgM抗體及肺炎衣原體IgM抗體。

1.2.5 痰培養(yǎng)留取 在抗菌藥物使用前，用彎壓舌板向后壓舌，將棉拭子伸入咽部，患兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時(shí)，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上。將棉拭子密封，立即送至檢驗(yàn)科微生物室接種培養(yǎng)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本次研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)連續(xù)變量用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)；分類資料組間比較用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson法。統(tǒng)計(jì)顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1CAP組與對照組比較

兩組在性別和年齡上無差異（P＞0.05），兩組HBD-1濃度有顯著差異（P＜0.05），見表1。

2.2 不同病原體感染

病毒、細(xì)菌及肺炎支原體或肺炎衣原體組的CAP組與對照組之間HBD-1水平比較顯示：各組在性別上無差異，在年齡上細(xì)菌組、肺炎支原體或肺炎衣原體組與病毒組、對照組有差異；不同病原體感染CAP兩兩之間HBD-1水平比較無顯著差異（P＞0.05）；而對照組HBD-1水平低于各病原體組（F=7.719，P＜0.05），見表2。

表1 CAP組與對照組HBD-1比較Table 1 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level compared between community-acquired pneumonia children and control subjects

表2 不同病原體肺炎之間HBD-1比較Table 2 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia in terms of pathogen

2.3 重度肺炎和輕度肺炎比較

重度肺炎和輕度肺炎比較：兩組在性別上無顯著差異，在年齡上有顯著差異，前者年齡顯著小于后者，但兩者HBD-1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞?0.05），見表3。

表 3 重度肺炎和輕度肺炎HBD-1水平比較Table 3 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia in terms of disease severity

2.4CAP 不同年齡組HBD-1水平對比

不同年齡組在性別上無差異，＞6個(gè)月～12個(gè)月組HBD-1顯著高于其他組（F=9.818，P＜0.05）

表4 不同年齡組HBD-1水平比較Table 4 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia by age group

2.5 相關(guān)性分析

HBD-1水平與CRP和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：HBD-1水平與CRP 相關(guān)性r =0.103，P=0.294，兩者相關(guān)性極低且無效；HBD-1水平與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性r =0.032，P=0.742，兩者相關(guān)性極低且無效。

3 討論

HBD是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的小分子陽離子內(nèi)源性抗微生物肽，富含半胱氨酸、精氨酸，是生物長期與疾病對抗中進(jìn)化而來的，參與機(jī)體最初防御活動(dòng)，是極為重要的一類內(nèi)源性抗菌肽[5]。據(jù)半胱氨酸殘基的位置和二硫鍵連接方式，HBD分為α、β、θ 3種，HBD-1存在于哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞中[6]，目前發(fā)現(xiàn)6種人HBD，其中HBD-1于1995年由德國學(xué)者最先從經(jīng)受透析治療的腎衰竭患者的血漿中發(fā)現(xiàn)[1]，在以后的研究中發(fā)現(xiàn)其基因可在上皮細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)[7]，包括氣管、細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞及黏膜下腺體、腎臟、泌尿生殖道、扁桃體及牙齦細(xì)胞等。已有研究表明，HBD-1在呼吸道黏膜上皮抵抗微生物入侵、在肺的免疫炎性反應(yīng)中起著重要作用[5]，且近年來研究發(fā)現(xiàn)人HBD-1對益生菌無作用，故不會打破人體腸道菌群的平衡[8]，對HBD的研究有待深入。

本研究中，以CAP患兒為研究對象，發(fā)現(xiàn)CAP組與對照組的HBD-1水平有顯著差異，CAP中無論細(xì)菌、病毒、肺炎支原體或肺炎衣原體組的HBD-1水平遠(yuǎn)高于對照組，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而病毒組、細(xì)菌組及肺炎支原體或肺炎衣原體組的HBD-1水平的兩兩對照研究，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究認(rèn)為HBD-1基因表達(dá)不受脂多糖等炎性因子的刺激，無轉(zhuǎn)錄調(diào)解因子NFKB的結(jié)合位點(diǎn)，故一直以來被認(rèn)為是固有表達(dá)[9]。而新近的研究發(fā)現(xiàn)卡介苗能增強(qiáng)體外人肺腺癌細(xì)胞（SPC-A-1） HBD-1 mRNA的表達(dá)及其抗菌活性，增強(qiáng)表達(dá)具有刺激物劑量和時(shí)間依賴性[10]。在本研究中HBD-1表達(dá)水平在CAP各組之間均無顯著性差異，且HBD-1水平與CRP和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性極低，這表明細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等病原體的感染，均能誘導(dǎo)機(jī)體HBD-1的表達(dá)，對感染的病原體均有廣譜的抗微生物活性，在一定程度上參與感染性疾病的全身炎性反應(yīng)。另據(jù)張濤等[11]研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)肺炎的患兒血清HBD-1顯著低于健康對照組；反復(fù)肺炎嬰幼兒存在血清HBD-1、IgA、IgG水平低下的現(xiàn)象，提示呼吸道免疫防御功能存在障礙，這可能是嬰幼兒反復(fù)肺炎的免疫因素之一。本研究表明重度肺炎與輕度肺炎外周血HBD-1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其在感染型疾病的表達(dá)和應(yīng)激方面無差異。研究發(fā)現(xiàn)新生兒氣道黏膜可分泌包括HBD-1在內(nèi)的內(nèi)源性抗菌肽，其水平與成人的相當(dāng)。當(dāng)存在感染及炎性反應(yīng)時(shí)，HBD-1表達(dá)即上調(diào)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，＞6個(gè)月～12個(gè)月組HBD-1顯著高于其他年齡組，考慮HBD-1為非特異免疫，出生后相對固定，而5～6個(gè)月后來自母體的IgG抗體減少甚至消失，感染機(jī)會增多，誘導(dǎo)機(jī)體HBD-1的表達(dá)增加，而作為非特異免疫，隨著年齡增長，不斷與致病及非特異病原體作對抗，從而導(dǎo)致對HBD-1的消耗。

綜上，CAP患兒的HBD-1呈高水平表達(dá)，說明HBD-1除了作為機(jī)體固有免疫的一部分參與到抗感染過程，而且在獲得性免疫方面亦可發(fā)揮重要的作用；而在CAP的病毒組、細(xì)菌組及肺炎支原體或肺炎衣原體組的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反映出HBD-1對各類病原體呈現(xiàn)出非特異性的、廣譜的抗感染免疫功能。

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