孫曉琴，邱東海，周海濤，譚貢霞，劉江波，張 靜

（1.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000；2.北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100023）

中醫(yī)認(rèn)為，過度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可導(dǎo)致元?dú)夂膿p，元?dú)獾膿p耗是機(jī)體出現(xiàn)力竭的主要原因。同時(shí)，長時(shí)間、大強(qiáng)度訓(xùn)練產(chǎn)生的疲勞，初期傷脾，受訓(xùn)練時(shí)間、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、恢復(fù)時(shí)間等因素的影響，久之則會(huì)傷腎。腎藏精，精化氣，腎氣作為生氣之源，是生命力活動(dòng)的原動(dòng)力。研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)正常的血流分布受運(yùn)動(dòng)應(yīng)激影響被打破，相關(guān)器官中的血流量發(fā)生了重新的分布，在肌肉等運(yùn)動(dòng)器官中聚集了大量的血液，內(nèi)臟尤其是腎臟中的血流量，伴隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的持續(xù)進(jìn)行和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不斷增加出現(xiàn)大幅下降，進(jìn)而引發(fā)“運(yùn)動(dòng)性腎缺血”。而當(dāng)運(yùn)動(dòng)完全停止后，大量的血液重新回流到腎臟，運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)期腎血流量則引發(fā)了腎臟的進(jìn)一步損傷。腎臟對(duì)缺血及缺血再灌注損傷表現(xiàn)的異常敏感，2個(gè)時(shí)相腎血流量的改變?cè)谶\(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷的整個(gè)過程中發(fā)揮著重要的作用 。腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNF-α）等一系列炎癥細(xì)胞因子在運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。 中藥對(duì)過度訓(xùn)練引發(fā)的運(yùn)動(dòng)性臟器損傷的保護(hù)作用已引發(fā)了全球運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)領(lǐng)域?qū)＜?、學(xué)者的高度重視。已有研究表明，鎖陽具有抗應(yīng)激，抗疲勞、抗氧化、清除自由基、提高過氧化物歧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化物的藥理作用。故本實(shí)驗(yàn)選用鎖陽對(duì)過度訓(xùn)練大鼠進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，觀察其是否可以對(duì)過度訓(xùn)練誘導(dǎo)的腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表達(dá)發(fā)生影響，從而減輕了腎臟的組織病理學(xué)改變，延緩或避免對(duì)腎臟的損害。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡72只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

鎖陽，產(chǎn)地甘肅，購自北京同仁堂藥店，批號(hào)：160925351。

1.3 動(dòng)物分組與訓(xùn)練及測(cè)試方案

72只大鼠以數(shù)字隨機(jī)分組法分為安靜對(duì)照組（C組，12只）、一般訓(xùn)練組（M組，12只）、過度訓(xùn)練組（OM組，24只）和鎖陽干預(yù)+過度訓(xùn)練組（CM組，24只）。CM組每天灌胃1次，劑量為4.5 g.kg-1（預(yù)實(shí)驗(yàn)得出最佳劑量），體積為5 mL.kg-1，其他組等量的生理鹽水。C組大鼠以常規(guī)方式進(jìn)行飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)和營養(yǎng)干預(yù)。M組大鼠以中等強(qiáng)度進(jìn)行為期6周的游泳訓(xùn)練（無負(fù)重），每周訓(xùn)練6天，每天訓(xùn)練1次。訓(xùn)練時(shí)間由20min遞增至120min。CM組和OM組則進(jìn)行6周的遞增負(fù)荷力竭游泳訓(xùn)練，每次訓(xùn)練均至力竭。負(fù)重量由1%逐漸遞增，至第6周負(fù)重量遞增至5%的體重，1天2訓(xùn)（上、下午各1次）。力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10 s仍無法露出水面為準(zhǔn)。C、M組大鼠未出現(xiàn)意外性死亡；CM組和OM組大鼠在訓(xùn)練過程中受多種因素影響，部分大鼠出現(xiàn)意外死亡。訓(xùn)練結(jié)束時(shí)，CM組僅剩余12只大鼠，OM組僅剩余10只大鼠。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

末次游泳訓(xùn)練24h后，各組大鼠以乙醚進(jìn)行適度麻醉后，自頸總動(dòng)脈取血5mL，37 ℃自然凝固，待血清出現(xiàn)后，放入冰箱24h后，4℃下3 000 r.min-1離心10 min后取上清液，置于-20℃冰箱中保存。剖腹后迅速取雙腎，剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污后，觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地，切取腎組織，以經(jīng)過消毒的鋁箔包好，投入液氮暫存，隨后凍存于-70℃冰箱待測(cè) 。

根據(jù)試劑盒說明采用測(cè)定相關(guān)指標(biāo)：血清肌酐（Jaffe苦味酸法），血清尿素氮（二乙酰-肟法），腎組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表達(dá)（免疫組織化學(xué)法）。相關(guān)試劑盒購自北京利德鴻奧科技有限公司。

1.5 腎臟病理變化、免疫組化結(jié)果半定量積分評(píng)價(jià)

參照Pallers標(biāo)準(zhǔn)及染色程度和范圍（著色范圍參照Riera等標(biāo)準(zhǔn) ）分別進(jìn)行腎臟病理變化和免疫組化結(jié)果半定量積分評(píng)價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異采用方差分析，等級(jí)計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為非常顯著性水平。

圖1 4組大鼠腎組織病理（HE，×400）

2 結(jié) 果

2.1 不同組別大鼠腎組織的病理學(xué)改變

從圖1可知，光鏡下C組、M組大鼠腎組織形態(tài)均沒有出現(xiàn)異常，腎小球和腎小管未發(fā)生淤血、變性和水腫，腎小管管腔中未發(fā)現(xiàn)管型。OM組大鼠腎小球出現(xiàn)明顯的淤血現(xiàn)象，小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡變性及管腔擴(kuò)張，管腔中有少量脫落的絨毛和上皮細(xì)胞及各種管型。CM組組織病理學(xué)改變較OM組存在明顯的改善。大鼠腎小球出現(xiàn)輕微的小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性，管腔擴(kuò)張現(xiàn)象，無蛋白管型和細(xì)胞管型。腎小管Pallers評(píng)分，C組、M組組間無顯著差異（P＞0.05），OM明顯高于C組（P＜0.01），CM組顯著低于OM（P＜0.05）（表1），且均未見腎小球2.2不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

表1 不同組別大鼠腎小管損害評(píng)分比較

表2 不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

表3 不同組別大鼠腎組織IL-1β蛋白表達(dá)水平比較

表4 不同組別大鼠腎組織IL-6蛋白表達(dá)水平比較

表5 不同組別大鼠腎組織TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

表6 不同組別大鼠腎組織IL-18蛋白表達(dá)水平比較

2.2 不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

從表2可知，C、M組間血清尿素氮和肌酐水平無顯著性差異（P=0.103，P=0.118，P＞0.05）；OM組顯著高于C組（P=0.006，P=0.003，P＜ 0.01）；CM組顯著低于 OM 組（P=0.031，P=0.028，P＜0.05）。

2.3 不同組別大鼠腎組織相關(guān)炎癥因子蛋白表達(dá)水平比較

從表3～表6可知，C、M組大鼠腎臟組織IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α蛋白僅有輕度表達(dá)，且組間不存在顯著性差異（P＞0.05）；OM組與C組間存在差異（P＜0.01或P＜0.05）；CM組較OM組有所緩解（P＜0.05）。

3 討 論

近年來有研究表明：腎臟組織炎癥因子的表達(dá)水平有效地反映運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷程度 。本實(shí)驗(yàn)采用6周的遞增負(fù)荷力竭游泳訓(xùn)練的訓(xùn)練方式，運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷動(dòng)物模型造模成功。大鼠腎臟組織相關(guān)炎癥因子的蛋白表達(dá)上調(diào)，引發(fā)了腎臟的炎性作用的大幅度增強(qiáng)，極大地?fù)p傷了腎臟功能，同時(shí)也引發(fā)了腎臟組織出現(xiàn)顯著的病理學(xué)改變；而采用適宜運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式的大鼠腎臟組織相關(guān)指標(biāo)未發(fā)生顯著性改變，說明適度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不會(huì)破壞腎臟組織中促炎因子與抑炎因子間的動(dòng)態(tài)平衡引發(fā)炎性作用，對(duì)腎功能不會(huì)造成損傷，組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生病理學(xué)改變。鎖陽干預(yù)組大鼠腎臟組織相關(guān)炎癥指標(biāo)、腎臟功能指標(biāo)較過度訓(xùn)練組有明顯改善，表明采用鎖陽對(duì)大鼠進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，可以有效地抑制運(yùn)動(dòng)性腎臟缺血再灌注損傷中相關(guān)炎性因子的過度表達(dá)，確保了正常的腎臟功能組織結(jié)構(gòu)。其機(jī)制可能為：鎖陽通過有效地提高機(jī)體內(nèi)多種抗氧化酶的活性，清除大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的過量的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生與發(fā)展及炎性細(xì)胞因子的過度生成與表達(dá)，確保了腎臟組織細(xì)胞膜的完整性、穩(wěn)定性和通透性，減輕對(duì)腎臟功能和組織結(jié)構(gòu)的損傷及機(jī)體的免疫機(jī)能。其機(jī)制可能為：（1）鎖陽富含的黃酮類、三萜類、多糖等多種活性物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，可以提高超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，降低脂質(zhì)過氧化物的濃度，清除體內(nèi)過量自由基 ；（2）鎖陽中含有的維生素E可以有效地減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除自由基。（3）鎖陽中含有的乙酸等酸性物質(zhì)較油脂更容易失去H.，可以有效地推遲和緩解脂質(zhì)的氧化，終止油脂氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳播，起到揮抗氧化劑的作用。

4 結(jié) 論

鎖陽通過抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18表達(dá)，明顯地減輕運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注引起的腎功能障礙和腎臟組織病理學(xué)改變。

[1]Bergamaschi C T， Boim M A， Moura LA. Effects of long-term training on the progression of chronic renal faiture in rats[J ].Med Sci Sports Exerc 1997，29（2）：169-174.

[2]Vlassara H，Torreggiani M，Post J B，et al. Role of oxidants/inflammation in declining renal function in chronic kidney disease and normal aging[J ].Kidney Int Suppl，2009，114： S3-11.

[3]齊艷華，蘇格爾.鎖陽的研究進(jìn)展.[J ].中草藥，2000，31（2）：146-148.

[4]周海濤，曹建民.補(bǔ)益中藥對(duì)運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J ].中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，32（6）：518-524.

[5]Paller MS，Hoidal JR，F(xiàn)erris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat. Jacrd of Clinical Inuestigation[J ].1984，74（4）：1156-1164.

[6]Riera M，Torras J，Cruzado JM，et al.The enhancement of endogenous cAMP with pituitary adenylates olypepyide protectsrat kidney against ischemia through the modulation of inflammatory response[J ].Transplantation，2001，72（7）：1217- 1223.

[7]郭林.大負(fù)荷訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠腎組織微細(xì)結(jié)構(gòu)變化和分子調(diào)控機(jī)理的探討[D ].北京：北京體育大學(xué)，2005：68-79.

[8]Flaws JA，Hirshfield AN，Hewitt JA，et al. Effect of bcl-2 on the primordial follicle endowment in the mouse ovary.[J ].Biol Reprod，2001，64（4）：1153-1159.

[9]石旦，何小舟，徐海燕，等.腎缺血再灌注損傷及其保護(hù)的研究進(jìn)展. [J ].醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（18）.

[10]羅軍德，張汝學(xué)，賈正平.鎖陽抗缺氧活性部位的藥理作用及機(jī)制研究. [J ].中藥材，2006，29（7）：743.