孫曉琴,邱東海,周海濤,譚貢霞,劉江波,張 靜
(1.贛南醫(yī)學(xué)院,江西 贛州 341000;2.北京聯(lián)合大學(xué),北京 100023)
中醫(yī)認(rèn)為,過度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可導(dǎo)致元?dú)夂膿p,元?dú)獾膿p耗是機(jī)體出現(xiàn)力竭的主要原因。同時(shí),長時(shí)間、大強(qiáng)度訓(xùn)練產(chǎn)生的疲勞,初期傷脾,受訓(xùn)練時(shí)間、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、恢復(fù)時(shí)間等因素的影響,久之則會(huì)傷腎。腎藏精,精化氣,腎氣作為生氣之源,是生命力活動(dòng)的原動(dòng)力。研究表明,劇烈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,機(jī)體內(nèi)正常的血流分布受運(yùn)動(dòng)應(yīng)激影響被打破,相關(guān)器官中的血流量發(fā)生了重新的分布,在肌肉等運(yùn)動(dòng)器官中聚集了大量的血液,內(nèi)臟尤其是腎臟中的血流量,伴隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的持續(xù)進(jìn)行和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不斷增加出現(xiàn)大幅下降,進(jìn)而引發(fā)“運(yùn)動(dòng)性腎缺血”。而當(dāng)運(yùn)動(dòng)完全停止后,大量的血液重新回流到腎臟,運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)期腎血流量則引發(fā)了腎臟的進(jìn)一步損傷。腎臟對(duì)缺血及缺血再灌注損傷表現(xiàn)的異常敏感,2個(gè)時(shí)相腎血流量的改變?cè)谶\(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷的整個(gè)過程中發(fā)揮著重要的作用 。腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)等一系列炎癥細(xì)胞因子在運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。 中藥對(duì)過度訓(xùn)練引發(fā)的運(yùn)動(dòng)性臟器損傷的保護(hù)作用已引發(fā)了全球運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)領(lǐng)域?qū)<?、學(xué)者的高度重視。已有研究表明,鎖陽具有抗應(yīng)激,抗疲勞、抗氧化、清除自由基、提高過氧化物歧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化物的藥理作用。故本實(shí)驗(yàn)選用鎖陽對(duì)過度訓(xùn)練大鼠進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù),觀察其是否可以對(duì)過度訓(xùn)練誘導(dǎo)的腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表達(dá)發(fā)生影響,從而減輕了腎臟的組織病理學(xué)改變,延緩或避免對(duì)腎臟的損害。
7周齡72只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠。
鎖陽,產(chǎn)地甘肅,購自北京同仁堂藥店,批號(hào):160925351。
72只大鼠以數(shù)字隨機(jī)分組法分為安靜對(duì)照組(C組,12只)、一般訓(xùn)練組(M組,12只)、過度訓(xùn)練組(OM組,24只)和鎖陽干預(yù)+過度訓(xùn)練組(CM組,24只)。CM組每天灌胃1次,劑量為4.5 g.kg-1(預(yù)實(shí)驗(yàn)得出最佳劑量),體積為5 mL.kg-1,其他組等量的生理鹽水。C組大鼠以常規(guī)方式進(jìn)行飼養(yǎng),不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)和營養(yǎng)干預(yù)。M組大鼠以中等強(qiáng)度進(jìn)行為期6周的游泳訓(xùn)練(無負(fù)重),每周訓(xùn)練6天,每天訓(xùn)練1次。訓(xùn)練時(shí)間由20min遞增至120min。CM組和OM組則進(jìn)行6周的遞增負(fù)荷力竭游泳訓(xùn)練,每次訓(xùn)練均至力竭。負(fù)重量由1%逐漸遞增,至第6周負(fù)重量遞增至5%的體重,1天2訓(xùn)(上、下午各1次)。力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10 s仍無法露出水面為準(zhǔn)。C、M組大鼠未出現(xiàn)意外性死亡;CM組和OM組大鼠在訓(xùn)練過程中受多種因素影響,部分大鼠出現(xiàn)意外死亡。訓(xùn)練結(jié)束時(shí),CM組僅剩余12只大鼠,OM組僅剩余10只大鼠。
末次游泳訓(xùn)練24h后,各組大鼠以乙醚進(jìn)行適度麻醉后,自頸總動(dòng)脈取血5mL,37 ℃自然凝固,待血清出現(xiàn)后,放入冰箱24h后,4℃下3 000 r.min-1離心10 min后取上清液,置于-20℃冰箱中保存。剖腹后迅速取雙腎,剔除筋膜,置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污后,觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地,切取腎組織,以經(jīng)過消毒的鋁箔包好,投入液氮暫存,隨后凍存于-70℃冰箱待測(cè) 。
根據(jù)試劑盒說明采用測(cè)定相關(guān)指標(biāo):血清肌酐(Jaffe苦味酸法),血清尿素氮(二乙酰-肟法),腎組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)法)。相關(guān)試劑盒購自北京利德鴻奧科技有限公司。
參照Pallers標(biāo)準(zhǔn)及染色程度和范圍(著色范圍參照Riera等標(biāo)準(zhǔn) )分別進(jìn)行腎臟病理變化和免疫組化結(jié)果半定量積分評(píng)價(jià)。
采用SPSS19.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間差異采用方差分析,等級(jí)計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)分析。以P<0.05為顯著性水平,P<0.01為非常顯著性水平。
圖1 4組大鼠腎組織病理(HE,×400)
從圖1可知,光鏡下C組、M組大鼠腎組織形態(tài)均沒有出現(xiàn)異常,腎小球和腎小管未發(fā)生淤血、變性和水腫,腎小管管腔中未發(fā)現(xiàn)管型。OM組大鼠腎小球出現(xiàn)明顯的淤血現(xiàn)象,小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡變性及管腔擴(kuò)張,管腔中有少量脫落的絨毛和上皮細(xì)胞及各種管型。CM組組織病理學(xué)改變較OM組存在明顯的改善。大鼠腎小球出現(xiàn)輕微的小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性,管腔擴(kuò)張現(xiàn)象,無蛋白管型和細(xì)胞管型。腎小管Pallers評(píng)分,C組、M組組間無顯著差異(P>0.05),OM明顯高于C組(P<0.01),CM組顯著低于OM(P<0.05)(表1),且均未見腎小球2.2不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較
表1 不同組別大鼠腎小管損害評(píng)分比較
表2 不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較
表3 不同組別大鼠腎組織IL-1β蛋白表達(dá)水平比較
表4 不同組別大鼠腎組織IL-6蛋白表達(dá)水平比較
表5 不同組別大鼠腎組織TNF-α蛋白表達(dá)水平比較
表6 不同組別大鼠腎組織IL-18蛋白表達(dá)水平比較
從表2可知,C、M組間血清尿素氮和肌酐水平無顯著性差異(P=0.103,P=0.118,P>0.05);OM組顯著高于C組(P=0.006,P=0.003,P< 0.01);CM組顯著低于 OM 組(P=0.031,P=0.028,P<0.05)。
從表3~表6可知,C、M組大鼠腎臟組織IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α蛋白僅有輕度表達(dá),且組間不存在顯著性差異(P>0.05);OM組與C組間存在差異(P<0.01或P<0.05);CM組較OM組有所緩解(P<0.05)。
近年來有研究表明:腎臟組織炎癥因子的表達(dá)水平有效地反映運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷程度 。本實(shí)驗(yàn)采用6周的遞增負(fù)荷力竭游泳訓(xùn)練的訓(xùn)練方式,運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷動(dòng)物模型造模成功。大鼠腎臟組織相關(guān)炎癥因子的蛋白表達(dá)上調(diào),引發(fā)了腎臟的炎性作用的大幅度增強(qiáng),極大地?fù)p傷了腎臟功能,同時(shí)也引發(fā)了腎臟組織出現(xiàn)顯著的病理學(xué)改變;而采用適宜運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式的大鼠腎臟組織相關(guān)指標(biāo)未發(fā)生顯著性改變,說明適度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不會(huì)破壞腎臟組織中促炎因子與抑炎因子間的動(dòng)態(tài)平衡引發(fā)炎性作用,對(duì)腎功能不會(huì)造成損傷,組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生病理學(xué)改變。鎖陽干預(yù)組大鼠腎臟組織相關(guān)炎癥指標(biāo)、腎臟功能指標(biāo)較過度訓(xùn)練組有明顯改善,表明采用鎖陽對(duì)大鼠進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù),可以有效地抑制運(yùn)動(dòng)性腎臟缺血再灌注損傷中相關(guān)炎性因子的過度表達(dá),確保了正常的腎臟功能組織結(jié)構(gòu)。其機(jī)制可能為:鎖陽通過有效地提高機(jī)體內(nèi)多種抗氧化酶的活性,清除大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的過量的自由基,抑制脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生與發(fā)展及炎性細(xì)胞因子的過度生成與表達(dá),確保了腎臟組織細(xì)胞膜的完整性、穩(wěn)定性和通透性,減輕對(duì)腎臟功能和組織結(jié)構(gòu)的損傷及機(jī)體的免疫機(jī)能。其機(jī)制可能為:(1)鎖陽富含的黃酮類、三萜類、多糖等多種活性物質(zhì)具有較高的抗氧化活性,可以提高超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性,降低脂質(zhì)過氧化物的濃度,清除體內(nèi)過量自由基 ;(2)鎖陽中含有的維生素E可以有效地減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng),清除自由基。(3)鎖陽中含有的乙酸等酸性物質(zhì)較油脂更容易失去H.,可以有效地推遲和緩解脂質(zhì)的氧化,終止油脂氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳播,起到揮抗氧化劑的作用。
鎖陽通過抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18表達(dá),明顯地減輕運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注引起的腎功能障礙和腎臟組織病理學(xué)改變。
[1]Bergamaschi C T, Boim M A, Moura LA. Effects of long-term training on the progression of chronic renal faiture in rats[J ].Med Sci Sports Exerc 1997,29(2):169-174.
[2]Vlassara H,Torreggiani M,Post J B,et al. Role of oxidants/inflammation in declining renal function in chronic kidney disease and normal aging[J ].Kidney Int Suppl,2009,114: S3-11.
[3]齊艷華,蘇格爾.鎖陽的研究進(jìn)展.[J ].中草藥,2000,31(2):146-148.
[4]周海濤,曹建民.補(bǔ)益中藥對(duì)運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J ].中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2013,32(6):518-524.
[5]Paller MS,Hoidal JR,F(xiàn)erris TF. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat. Jacrd of Clinical Inuestigation[J ].1984,74(4):1156-1164.
[6]Riera M,Torras J,Cruzado JM,et al.The enhancement of endogenous cAMP with pituitary adenylates olypepyide protectsrat kidney against ischemia through the modulation of inflammatory response[J ].Transplantation,2001,72(7):1217- 1223.
[7]郭林.大負(fù)荷訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠腎組織微細(xì)結(jié)構(gòu)變化和分子調(diào)控機(jī)理的探討[D ].北京:北京體育大學(xué),2005:68-79.
[8]Flaws JA,Hirshfield AN,Hewitt JA,et al. Effect of bcl-2 on the primordial follicle endowment in the mouse ovary.[J ].Biol Reprod,2001,64(4):1153-1159.
[9]石旦,何小舟,徐海燕,等.腎缺血再灌注損傷及其保護(hù)的研究進(jìn)展. [J ].醫(yī)學(xué)綜述,2009,15(18).
[10]羅軍德,張汝學(xué),賈正平.鎖陽抗缺氧活性部位的藥理作用及機(jī)制研究. [J ].中藥材,2006,29(7):743.