王弦

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）為人類皰疹病毒第四型的簡稱，是多種惡性腫瘤（如鼻咽癌、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴上皮瘤樣癌等）的病因之一，主要感染人類口咽部的上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。EBER是EBV編碼的小RNAs，在EBV感染的細(xì)胞中有非常高的拷貝數(shù)，并且在病毒感染的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)[1-5]。

顯色原位雜交技術(shù)（chromogenic in situ hybridization，CISH）是以設(shè)計(jì)與標(biāo)本中的靶序列互補(bǔ)的探針為基礎(chǔ)，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過雜交、酶標(biāo)顯色，從而確定標(biāo)本中是否有目的核酸片段的一種檢測(cè)方法。筆者所在單位于2010年開展顯色原位雜交技術(shù)檢測(cè)石蠟切片中EBER，在此結(jié)合其近年的制片工作經(jīng)驗(yàn)，將本實(shí)驗(yàn)中常見問題及注意事項(xiàng)進(jìn)行介紹與探討。

1 材料與方法

1.1 材料收集

選取安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)科2014年6月—2016年3月 40例鼻咽部病理活檢組織，2名中級(jí)以上職稱病理醫(yī)生閱片，依據(jù)阿克曼外科病理學(xué)組織學(xué)類型分別為15例鼻咽黏膜慢性炎，25例鼻咽非角化鱗狀細(xì)胞癌，以上患者均未接受放射與化學(xué)治療。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定16 h，常規(guī)脫水透明浸蠟，石蠟包埋切片，切片厚度4 μm。

1.2 雜交試劑與設(shè)備

顯色原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，EBER探針為地高辛標(biāo)記的RNA探針；雜交儀為美國雅培ThermoBrite原位雜交儀；正電荷黏附載玻片購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；孵育溫箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

顯色原位雜交法檢測(cè)EBER步驟如下：（1）4 μm石蠟切片，62℃烤片2 h；（2）二甲苯脫蠟，無水酒精處理后干燥；（3）滴加胃蛋白酶工作液（預(yù)先配置），37℃消化15～30 min；（4）棄去胃酶，逐級(jí)酒精脫水，空氣干燥；（5）滴加探針5～10 μl，加蓋蓋玻片，雜交儀中37℃ 過夜；（6）次日取出切片，置入PBST緩沖液浸泡，直至蓋玻片脫落，PBST沖洗3×3 min；（7）滴加HRP-地高辛抗體，37℃ 30 min，PBST沖洗3×3 min；（8）DAB顯色，適時(shí)終止；（9）蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明，封片。

2 結(jié)果

經(jīng)顯色原位雜交檢測(cè)，EBER陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核，染色效果良好，無背景染色。15例鼻咽黏膜慢性炎中有2例EBER呈點(diǎn)狀陽性（陽性率13.3%），25例鼻咽非角化鱗狀細(xì)胞癌全部陽性（陽性率100%）。

3 討論

原位雜交技術(shù)（in situ hybrization，ISH）是分子病理的一門重要技術(shù)。經(jīng)過多年的發(fā)展，原位雜交技術(shù)根據(jù)探針標(biāo)記物的不同，主要分為顯色原位雜交（chromogenic in situ hybridization，CISH），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）；根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，可分為DNA-DNA雜交，RNA-DNA雜交及RNA-RNA雜交。本文檢測(cè)EB病毒所采用是RNA-RNA雜交的顯色原位雜交法。對(duì)于臨床病理檢測(cè)來說，無論是剛開展此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室還是已經(jīng)熟練掌握此技術(shù)的單位都應(yīng)建立自己的質(zhì)控體系，現(xiàn)將從以下幾個(gè)方面對(duì)本實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)進(jìn)行介紹：

3.1 良好的實(shí)驗(yàn)操作

工作人員具備良好的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)是完成此項(xiàng)工作的基礎(chǔ)，操作者應(yīng)具備基本的分子生物學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)相關(guān)知識(shí)結(jié)構(gòu)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，專人負(fù)責(zé)，嚴(yán)格質(zhì)控；EBER是EBV編碼的小RNA，具有較高的拷貝數(shù)，大量存在于EBV潛伏感染的細(xì)胞核中，其具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不像細(xì)胞內(nèi)其他的RNA分子容易降解[6]，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程與以往科研實(shí)驗(yàn)中涉及RNA的原位雜交有所不同，但不代表完全不需要注意RNA酶的問題，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程盡量避免皮膚直接接觸切片，應(yīng)帶口罩、手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

3.2 完善的組織固定

對(duì)于原位雜交實(shí)驗(yàn)來說，組織固定最主要的目的是最大限度的保存核酸的完整。因此應(yīng)選擇良好的固定液以及及時(shí)有效的固定，建議組織離體以后立即投入中性緩沖福爾馬林液中，固定時(shí)間一般需要在12～24 h。

3.3 良好的切片

為防止實(shí)驗(yàn)過程脫片，建議使用防脫載玻片，目前市場(chǎng)上陽離子玻片使用效果良好；同時(shí)，切片過程應(yīng)完整無刀痕，為保證切片中有足夠的EBER核酸拷貝數(shù)，故厚度不能太薄，一般應(yīng)在3～4 μm。

3.4 組織的烤片及脫蠟

切片烤片溫度應(yīng)在62～65℃，溫度不宜過高，烤片時(shí)間≥2 h，這樣能較好的保證核酸的完整性；脫蠟應(yīng)徹底，否則影響后期酶的消化以及探針的穿透。

3.5 合理的消化

眾所周知，酶消化的作用是增加組織的通透和增強(qiáng)探針的穿透[7]。本實(shí)驗(yàn)選用的酶是胃蛋白酶，為保證酶的活性，建議臨用臨配，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說明，以保證酶的pH值；酶在消化的過程中，針對(duì)不同的組織，時(shí)間也應(yīng)有所差別，不可千篇一律[6]。為了保證消化的合理，建議在消化過程中用顯微鏡觀察組織消化程度，當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)“荷包蛋”凸起時(shí)，方可適時(shí)終止消化。

3.6 雜交

雜交是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。筆者實(shí)驗(yàn)室所使用的是北京中杉金橋公司生產(chǎn)的EBER原位雜交檢測(cè)試劑盒，為提高低拷貝數(shù)病毒的檢出率，防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，建議采用過夜雜交的方式進(jìn)行，一般雜交時(shí)間≥10 h可獲得較好的實(shí)驗(yàn)效果。因本實(shí)驗(yàn)是RNA-RNA雜交，不涉及DNA雙鏈的解旋，因此沒有變性的步驟，所以避免了因變性不徹底導(dǎo)致的雜交效率底的弊端。在滴加探針時(shí)，因氣泡的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致組織局部沒有探針覆蓋，故應(yīng)防止氣泡的產(chǎn)生，可采取將探針滴加在蓋玻片上，然后采用“反吸”的方式；探針的滴加量沒有固定的要求，原則是整張切片完全被探針覆蓋；探針滴加蓋玻片加蓋之后，為防止孵育過程中干片，可以在蓋玻片四周加封橡膠水泥；雜交的過程，建議有條件的單位盡量選擇原位雜交儀進(jìn)行[8]，原因主要有三個(gè)方面：（1）雜交儀操作便捷，相對(duì)于恒溫箱而言，條件設(shè)定恒定，人為干擾因素較少；（2）雜交儀中的加熱板使切片雜交溫度更均勻和準(zhǔn)確；（3）雜交儀是密閉的系統(tǒng)，對(duì)于切片雜交的濕度環(huán)境要求和避光環(huán)境非常適合。

3.7 雜交后洗滌及抗體孵育

雜交后洗滌要充分徹底，去除蓋玻片四周的橡膠水泥之后，建議直接放入洗滌液浸泡10～15 min，使蓋玻片自動(dòng)脫落，這樣可以防止直接揭去蓋玻片時(shí)粘去待檢組織；洗滌液采用PBST（PBS+Tween20），Tween20是良好的表面活性劑，可以有效的去除非特異性染色背景；抗地高辛抗體孵育時(shí)間和溫度應(yīng)嚴(yán)格把握，時(shí)間過久、溫度過高都會(huì)產(chǎn)生非特異性背景染色；抗體滴加應(yīng)充分甩干切片上的緩沖液，緩沖液殘留會(huì)稀釋抗體出現(xiàn)假陰性，另外濕盒孵育要防止干片，抗體蒸發(fā)會(huì)間接導(dǎo)致抗體濃度提高，出現(xiàn)非特異性染色。

3.8 顯色和蘇木素襯染

抗體采用辣根過氧化物酶標(biāo)記，顯色時(shí)用DAB顯色劑，顯色時(shí)間應(yīng)在顯微鏡下控制，避免因顯色時(shí)間過久產(chǎn)生背景染色；由于EBER陽性定位在細(xì)胞核，所以蘇木素襯染不應(yīng)過深，否則影響會(huì)覆蓋陽性信號(hào)，影響判讀。

3.9 對(duì)照的設(shè)立

在正確實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)上，建議每一張切片都附上陽性質(zhì)控對(duì)照，可以選用日常工作中積累的已經(jīng)確定的陽性蠟塊，也可以采用液態(tài)陽性對(duì)照[9]。

綜上所述，顯色原位雜交技術(shù)檢測(cè)石蠟切片中EBER是目前診斷EB病毒感染的最有效、最準(zhǔn)確的方法，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中須準(zhǔn)確掌握實(shí)驗(yàn)原理、把握實(shí)驗(yàn)技巧、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程及設(shè)置合理對(duì)照，才能制作出良好的切片，為診斷提供有效依據(jù)。

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