袁蓮，劉玉嬌，何歡，蔣風雷，李會榮，劉義,＊

1 引言

在自然界中，生命的代謝過程最終是一個放熱過程，量熱分析是生物分析中的一個重要方法，被廣泛用于研究微生物的熱量代謝。其實時長期的監(jiān)測、對數(shù)值的精密響應，是其他傳統(tǒng)分析方法不能做到的。近年來，微量熱法的應用越來越廣泛，不僅包括生物大分子相互作用、細菌、酵母、土壤中微生物等的微量熱研究，而且已經滲透到我們生活各個領域1-4。

線粒體是能量代謝的重要場所，食物被消化后進入細胞，被分解成所需要的分子，進入線粒體進行三羧酸循環(huán)，然后轉化成線粒體電子傳遞鏈所需要的底物，促進線粒體的呼吸并合成ATP，為生命活動提供能量5。線粒體最重要的功能是通過氧化磷酸化過程來合成 ATP，為生物體提供能量。氧化磷酸化主要在呼吸鏈(電子傳遞鏈)上進行。顧名思義，呼吸鏈即是呼吸的過程，人體吸入的氧氣也是在呼吸鏈上被還原。線粒體呼吸鏈由5種不同的蛋白復合物組成，分別是：復合物I、II、III、IV和 V。這些復合物嵌在內膜的磷脂雙分子層之間，電子經由這幾種復合物及幾種游離的電子傳遞物質依次傳遞，最終的結果是消耗氧氣，生成 ATP。在線粒體中，ATP的生成分為兩個階段。第一個階段，通過電子傳遞鏈的作用，NADH和FADH2提供質子，這創(chuàng)造了內膜兩側的電化學梯度，允許質子跨越內膜。電子的載體(復合物I-V)將電子逐步地從NADH傳遞到O2。復合物中的三種(I、III、IV)也能運輸質子，在傳遞電子的同時將質子從基質泵出到膜間腔。泵出的質子又創(chuàng)造了內膜兩側的質子梯度。因此，線粒體內膜兩側具有一定的跨膜電勢，通常是 150-180 mV，膜間腔側為正，基質側為負6。第二個階段，復合物V即ATP合成酶消耗質子梯度，將質子再運回到基質，并利用勢能合成ATP7。然后，ATP通過腺嘌呤核苷酸轉運酶(ANT)運輸?shù)骄€粒體外，為細胞提供能量8。線粒體在細胞中的功能非常重要，其功能減退能引起許多疾病，尤其是對能量需求量大的器官和部位，如大腦、心臟和肌肉等9,10。當線粒體功能受到損傷時，例如 Ca2+穩(wěn)態(tài)失調或線粒體Ca2+過載，將會導致活性氧(ROS)的增加，ROS能攻擊蛋白、脂質和DNA，造成線粒體功能的進一步損傷，從而線粒體滲透轉換孔(MPTP)開放的幾率增加，線粒體膜間腔中的細胞色素 c等凋亡因子釋放到細胞質中，調控細胞的程序性死亡11。

有文獻報道，線粒體將會成為治療疾病的普遍機制11，基于此，線粒體靶向藥物也成為了研究的熱點12-16。無論是考察藥物的生物安全性，還是考察其對線粒體的結構與功能的影響，僅從個體或細胞層面分析線粒體具有一定的難度，因此體外線粒體的研究是探討毒理和藥理的有效手段之一。線粒體從組織內提取出來后，往往因為其活性時間短而使得對其性質的研究受到限制。常見的體外線粒體研究局限在4 h之內，包括用光譜法檢測線粒體的腫脹、膜電位差、膜流動性，用電極法檢測線粒體的耗氧速率等17。然而，線粒體是細胞內產能的細胞器，研究藥物對其活性影響的長期過程尤為重要。離體線粒體在數(shù)小時之后，活性會降低，但是并未完全喪失，傳統(tǒng)的方法難以繼續(xù)研究線粒體的活性變化過程。而且藥物對機體的作用往往有一個長時間的積累過程，為了補充體外線粒體實驗方法的不足，本論文利用熱活性檢測儀TAM III考察了長時間內對離體線粒體能量代謝的監(jiān)控，獲得了不同條件下，離體線粒體的功率-時間曲線，并通過計算得到了線粒體能量代謝的熱動力學參數(shù)。本實驗使用了已知的工具藥，包括 Ca2+、不同底物、不同緩沖液以及一系列線粒體抑制劑，旨在揭示不同條件下體外線粒體代謝的基本特征，為線粒體的探究提供了方法。

2 實驗部分

2.1 試劑和溶液

蔗糖(sucrose)；甘露醇(mannitol)；4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)；三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)；乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)；3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)；MgCl2；KH2PO4；Na3PO4；CaCl2；KNO3；KCl；KAc；琥珀酸鈉(sodium succinate)；丙酮酸鈉(sodium pyruvate)；丙二酸鈉(sodium malonate)；NaN3，以上藥品均為 AR級，購于武漢欣申試化工科技有限公司。魚藤酮(rotenone)；寡霉素(oligomycin)；纈氨霉素(valinomycin)；環(huán)孢菌素A(CsA)，以上藥品純度＞ 99%，購自美國 Sigma公司。實驗用水為去離子水。

緩沖溶液的配制：按照表1配方，配制7種緩沖液，調節(jié)到相應的pH值。

2.2 線粒體提取

依據(jù)細胞中各組分密度不同，本文采用差速離心法提取大鼠肝臟線粒體18。肝臟組織剪碎并在Buffer A中勻漿后，在4 °C條件下離心3 min，離心力為1000 g。取上清液，在10000 g條件下離心4 min，棄去上清液，將沉淀分散于Buffer A中，以同樣的條件離心4 min。再將沉淀分散于Buffer B中，以同樣的條件離心4 min。最后獲得富含線粒體的顆粒，分散于Media C中，置于4 °C冰箱保存。線粒體中蛋白的濃度用雙縮脲法測定19，最終富集的蛋白濃度約為50 mg·mL-1。

表1 7種緩沖液的組分Table 1 The components of 7 buffers.

2.3 線粒體能量代謝

新提取的線粒體分散液保存于0 °C冰水浴中8 h，使用TAM III微量熱儀30 °C進行實時檢測。安瓿瓶中加入線粒體及所需的藥物，用 Media C(研究不同緩沖液時除外)補充至總體積為1 mL，壓蓋密封，按照儀器操作要求進樣。安瓿瓶及其他耗材需要提前滅菌，加樣過程在無菌環(huán)境下進行。

3 結果與討論

3.1 不同濃度線粒體的能量代謝

從大鼠肝臟中提取出線粒體后，用透射電鏡、液相溶氧系統(tǒng)、紫外-可見光譜、熒光光譜等手段對其進行了表征，結果證明提取物為純度較高、活性強的線粒體17。透射電鏡觀察到線粒體雙層膜完整、嵴清晰可見、電子密度高，說明線粒體結構完整。用羅丹明 123作為熒光染料檢測線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)25 °C下1 h內線粒體膜電位未降低，說明新提取的線粒體能夠維持其膜功能。同時，由于線粒體是有氧呼吸的場所，本文在進行量熱實驗之前，用液相溶氧系統(tǒng)測量了線粒體的耗氧速率，并計算了呼吸控制率。呼吸控制率是反映線粒體呼吸鏈酶功能的重要指標，通?；钚暂^好的線粒體，呼吸控制比達到3。本實驗中，線粒體的呼吸控制率都大于3，說明線粒體保有良好的耗氧和合成ATP的功能17。然而短時間內對線粒體的檢測不足以闡述線粒體的性質，因此本文用微量熱法對離體線粒體進行了長期、實時的監(jiān)測，獲得了功率―時間曲線。線粒體代謝是一個指數(shù)式產熱的過程，生長過程中的產熱功率也呈指數(shù)式增加，此過程的產熱曲線對應于如下方程20：

式中 k是新陳代謝速率常數(shù)，t是代謝時間，P0和Pt分別是時間為0和時間為t時的熱輸出功率。對量熱儀所記錄的數(shù)據(jù) Pt取對數(shù)，并以 lnPt對 t進行線性擬合，可以得到線粒體新陳代謝速率常數(shù)(k)。當藥物或其他物質加入到生物體系時，對生長代謝有一定的影響，生長速率常速 k通常也會發(fā)生相應的變化。因此，可以通過 k的變化，來分析藥物或其他物質對線粒體活性的影響。除此之外，通過計算還可獲得線粒體代謝過程中的其他熱動力學參數(shù)，包括總熱量釋放(Q)、最大產熱功率(Pmax)和最大產熱功率時間(tmax)。

圖 1是不同濃度線粒體的產熱曲線，線粒體的量熱曲線包含一個主峰和一個肩峰。在相同條件下，7.0與3.5 mg protein·mL-1的線粒體，第一個峰位置相同。線粒體濃度越高時，最大產熱功率越高，且第二個峰出現(xiàn)更早，說明線粒體含量越多時，代謝速率越快。從表2a中的熱動力參數(shù)可以看出，高濃度線粒體的代謝速率常數(shù)，包括兩個熱活性增長速率常數(shù) k1、k2和熱活性衰減速率常數(shù) k3，都比低濃度時大。雖然高濃度線粒體產熱更快，出峰時間更早，但是總的產熱量卻相差不大。這是由于在線粒體進行正常代謝時，總的產熱量取決于反應體系中的總含氧量，當氧氣耗盡時，線粒體的氧化過程不能繼續(xù)進行，因此總熱量保持在一個穩(wěn)定的數(shù)值范圍之內。在本文的實驗條件下，產熱量通常為10 J左右。

圖1 15 mmol·L-1琥珀酸鈉作為底物時不同濃度線粒體的熱量曲線Fig.1 Thermogenic curves of mitochondria with 15 mmol·L-1 of succinate as respiratory substrate.

3.2 不同底物對線粒體代謝的影響

呼吸鏈是線粒體中非常重要的功能組成部分，包含復合物 I (NADH脫氫酶和鐵-硫蛋白組成)、復合物II (琥珀酸脫氫酶和硫鐵蛋白組成)、復合物III (細胞色素c氧化還原酶復合體，含有鐵硫蛋白)、復合物IV (細胞色素c氧化酶復合體，含有鐵硫蛋白)和ATP合成酶(ATPase)。由I-III-IV組成的電子傳遞鏈為主呼吸鏈，由 II-III-IV組成的電子傳遞鏈為次呼吸鏈。呼吸鏈傳遞電子的過程中將質子由線粒體基質泵出到線粒體內膜外側，而ATPase則利用質子回到基質的勢能，合成ATP，輸送給細胞，此過程中O2在復合物IV上被還原成 H2O。因此，呼吸鏈是線粒體能量代謝中最重要的部分21。圖 2反映了相同條件下加入不同底物時，離體線粒體的產熱曲線，此實驗中所用的線粒體濃度為7.0 mg protein·mL-1。琥珀酸鈉是呼吸鏈復合物II的直接底物，顯示出了最大的產熱功率和最大的新陳代謝速率，如表2b所示。丙酮酸鈉也是線粒體中重要物質之一，是糖酵解的產物，被丙酮酸脫氫酶轉化成為乙酰輔酶 A，后者是檸檬酸循環(huán)的起始物質22。丙酮酸鈉作為底物時，最大產熱功率、峰位置和熱活性增長速率常數(shù)，均小于琥珀酸鈉，但大于不加底物的情況。本實驗說明，在直接底物琥珀酸鈉的作用下，線粒體具有更大的產熱功率和更快的熱量響應，而不加底物時，產熱速率最緩慢。實驗結果符合線粒體的結構與功能原理。

表2 不同條件下線粒體能量代謝的熱動力學參數(shù)Table 2 Thermokinetic parameters of mitochondrial metabolism in different conditions.

3.3 Ca2+和CsA對線粒體能量代謝的影響

在線粒體的研究中，CsA和 Ca2+是最常用到的工具藥。CsA是經典的線粒體滲透轉換孔(MPT)抑制劑，能夠有效保護線粒體受多種物質誘導引起的MPT23,24。MPTP是非特異性的通道，由線粒體基質側親環(huán)素D (Cyp D)、線粒體內膜上的腺嘌呤核苷酸轉運酶(ANT)和線粒體外膜上的VDAC組成25。MPT發(fā)生后，溶劑以及小分子進入線粒體基質，引起線粒體膜電位的喪失、基質腫脹以及凋亡因子釋放，在線粒體途徑誘導的細胞凋亡中占有重要地位。Ca2+是細胞的第二信使，對于細胞功能的調控起著不可或缺的作用。線粒體是細胞的鈣庫，調節(jié) Ca2+在細胞中的濃度以維持細胞的正常功能。過量的 Ca2+能引起線粒體腫脹、膜電勢坍塌，文獻表明 Ca2+損傷線粒體的途徑為誘導MPTP的開放26，而這種效應能被CsA所完全抑制27。本研究考察了低濃度和高濃度下Ca2+對離體線粒體能量代謝的影響。如圖 3和表2c所示，低濃度Ca2+(0.1 mmol·L-1)對線粒體產熱沒有明顯影響，而高濃度Ca2+(2.5 mmol·L-1)不僅使線粒體的產熱大大提前，最大產熱功率達到 2倍，同時總產熱量也接近2倍，說明高濃度Ca2+明顯地加快了線粒體的代謝。由于過量的 Ca2+對線粒體功能有損傷作用，因此，過早的產熱代表著線粒體產熱功能不再受到調控，而是爆發(fā)式地將O2耗盡然后衰亡。由圖可知，通常線粒體的代謝分為幾個階段：活性停滯期、產熱期和衰亡期。量熱實驗之前，線粒體儲存于0 °C冰水浴中8-10 h，旨在使線粒體活性停滯，以便于加入到30 °C TAM III之后，能夠觀察到完整的熱量曲線。進樣后，通常離體線粒體活性的停滯期長達10 h，然后開始進行代謝并且產生熱量。電子經呼吸鏈傳遞，O2被復合物IV還原，ATP合成酶生成ATP，這一系列的化學反應過程伴隨著熱量的產生。當Ca2+過量時，引起ROS水平的上升，ROS攻擊蛋白、脂質和DNA，使之發(fā)生了不可逆轉的氧化反應，此時產熱曲線不同于對照組，熱量除了在正常消耗O2的過程中產生外，還伴隨著其他一系列非正常的氧化反應。正因如此，與其他實驗結果所不同的是，在高濃度 Ca2+作用下，產熱的總量并不只依賴于容器中氧氣的總量，還發(fā)生了其他產熱反應，導致總產熱量加倍。CsA盡管能夠抑制 Ca2+誘導的線粒體腫脹及膜去極化，然而在長時期的代謝中，CsA的加入卻沒有對 Ca2+的影響產生作用。本實驗結果說明，線粒體的短期檢測與長期代謝的結果并不完全一致，因此用微量熱法測量線粒體的熱量代謝是研究藥物與線粒體相互作用的重要手段。

圖2 不同底物存在時線粒體的熱量曲線Fig.2 Thermogenic curves of mitochondria with different substrates.

圖3 Ca2+和CsA存在時線粒體的熱量曲線Fig.3 Thermogenic curves of mitochondria with Ca2+ and CsA.

3.4 不同緩沖液中線粒體的能量代謝

圖 4為不同緩沖中線粒體的能量代謝曲線。除了常用作生物介質的磷酸緩沖液外，另外幾種溶液分別為提取及純化后線粒體的儲存液 Media C、用于檢測線粒體腫脹和膜電位等性質的緩沖液(Mitochondrial analysis buffer，MAB)、用于檢測線粒體耗氧速率的緩沖液(Mitochondrial respiratory buffer，MRB)、用于檢測內膜對 H+和K+滲透能力的緩沖液(Buffer H，Buffer K)28。6種不同的緩沖液中，線粒體的能量代謝顯示出了最明顯的區(qū)別。以不含營養(yǎng)物質的 PBS為界限，Buffer K由于與線粒體不等滲，線粒體逐漸發(fā)生腫脹，跨膜電勢逐漸下降，因此抑制了線粒體的代謝。Media C中含有蔗糖和甘露醇，MAB和MRB中含有蔗糖，可能是這三種緩沖液中，線粒體的熱活性增長速率常數(shù)比PBS中大且產熱更快的主要原因。由于 MAB中含有呼吸底物琥珀酸鈉，因而產熱功率最大。

圖4 不同緩沖液中線粒體的熱量曲線Fig.4 Thermogenic curves of mitochondria with different buffers.

Buffer H則完全抑制了線粒體的產熱。Buffer H與Buffer K的差異在于，將KNO3換成了KAc和纈氨霉素。線粒體內膜具有高度選擇性，不允許大部分分子和離子通過，包括質子，因此探究線粒體功能變化時，通常會考察內膜對 H+和 K+的透過能力。檢測內膜對K+滲透能力時，緩沖液中加入了 135 mmol·L-1的 KNO3，由于 NO3-可以自由穿透內膜，因此其對電位差沒有影響，而K+不能自由進出內膜，在電位差的驅動下，K+會由內膜上的K+通道轉運入基質，引起電位差的下降，線粒體發(fā)生腫脹，540 nm處的吸光度下降29。以此通過線粒體吸光度的下降程度來判斷內膜對K+通透性的變化。而檢測內膜對H+的滲透能力時，緩沖液中加入的是 1 μg·mL-1纈氨霉素和 135 mmol·L-1KAc。K+對電位差的影響在脂溶性 K+載體纈氨霉素的運載下被消除掉。Ac-不能透過內膜，而HAc能透過內膜30。內膜外側的H+與Ac－結合，以HAc的方式進入基質并解離，導致線粒體內膜兩側質子濃差消失，從而影響線粒體功能。為了探究Buffer H使線粒體能量代謝停止的原因，我們進一步探究了 Ac-和纈氨霉素對線粒體能量代謝的影響。結果發(fā)現(xiàn)，纈氨霉素的加入并不會使線粒體產熱停止，而有KAc、KAc+纈氨霉素、NaAc、NaAc+纈氨霉素存在時，線粒體均不產熱。因此，使線粒體不產生熱量的根源在于 Ac-的引入。結合理論與實驗結果推測：有Ac-存在的情況下，線粒體無法保持內膜外側的質子濃度，而ATP的合成依賴于質子在ATP合成酶位點泵入基質而產生能量31，因此線粒體的熱量代謝受到抑制。同樣的現(xiàn)象未發(fā)生在Buffer K的情況下，是由于盡管K+的濃差消失，但是質子梯度仍可維持。然而更深層次的機理，還有待于進一步探討。

以上實驗為線粒體在不同條件下的能量代謝提供了理論基礎。由于線粒體存在多種不同的狀態(tài)：活性良好、活性較差、偶聯(lián)狀態(tài)、解偶聯(lián)狀態(tài)、富能量狀態(tài)和饑餓狀態(tài)等等，而不同的藥物對線粒體的影響不同，研究離體線粒體時只研究某一種狀態(tài)下的活性是遠遠不夠的。此外，同一種條件對不同的藥物可能產生限制，因此考察多種緩沖液以及多種條件下的線粒體性質具有重要意義。

3.5 呼吸鏈抑制劑對線粒體能量代謝的影響

呼吸鏈上的酶具有高效催化活性，是線粒體進行正常生理功能的必要條件。當呼吸鏈復合物受到抑制時，生物體的活性也會受到影響。魚藤酮是一種強殺蟲劑，通過抑制線粒體呼吸鏈復合物 I來抑制呼吸作用，是線粒體研究中應用較多的工具藥32。丙二酸鈉是復合物II的抑制劑，與琥珀酸鈉為競爭性抑制關系，因此對呼吸鏈具有抑制作用33,34。復合物IV是呼吸鏈中最重要的酶，其活性直接關系到生物體是否能存活。劇毒的氰化鉀可使人在數(shù)分鐘內死亡，因為 CN-與復合物IV緊密結合，使其不能進行電子傳遞。另外，對人生命具有巨大威脅的CO、疊氮酸都是復合物IV的抑制劑35,36。本文選用了幾種呼吸鏈抑制劑研究離體線粒體的能量代謝。

圖5 呼吸鏈抑制劑(魚藤酮、丙二酸鈉和NaN3)存在時線粒體的熱量曲線Fig.5 Thermogenic curves of mitochondria with several respiration inhibitors (rotenone, malonate and NaN3).

由圖5看出，40 μmol·L-1魚藤酮對線粒體的能量代謝抑制作用并不明顯，但是代謝速率常數(shù)明顯下降，如表2e所示，空白線粒體的熱量增長速率常數(shù)為0.436 h-1，而魚藤酮加入后，熱量增長速率常數(shù)下降至0.210 h-1。由于魚藤酮是復合物I的抑制劑，通常用于抑制復合物I的濃度為2 μmol·L-1，而本實驗中線粒體濃度約高其他實驗中的15倍，且為了顯示出其抑制效果，所選用的濃度為40 μmol·L-1。線粒體含有兩條呼吸鏈，加入魚藤酮后，由復合物 I開始的主呼吸鏈雖然受到抑制，但是琥珀酸鈉作為底物啟動的是以復合物II開始的次呼吸鏈，因此總體上魚藤酮對線粒體代謝的抑制不甚明顯。8 mmol·L-1丙二酸鈉是復合物II的競爭性抑制劑，由于本實驗中加入了15 mmol·L-1琥珀酸鈉作為底物，因此選擇了近似濃度的丙二酸鈉。丙二酸鈉加入后在前期刺激了線粒體的能量代謝，這是由于其與琥珀酸鈉都能作為復合物II的底物，然而由于其占據(jù)了琥珀酸鈉的位點，從而在第二段產熱期明顯地抑制了產熱增長速率。0.03 mmol·L-1NaN3對線粒體的代謝有少許的抑制作用，而0.3和3 mmol·L-1NaN3則徹底抑制了線粒體的代謝，說明在一定濃度下NaN3能夠使線粒體完全失活，這也驗證了NaN3對呼吸鏈的毒性。這三種呼吸鏈抑制劑都體現(xiàn)了對線粒體能量代謝的抑制作用，與已報道的藥物性質一致，說明微量熱實驗能夠反映出離體線粒體的功能和活性的變化，為今后探究各種生物材料對線粒體的可能毒理提供了實驗方法和理論依據(jù)。

4 結論

本研究以離體大鼠肝臟線粒體為模型，考察了不同條件下線粒體的能量代謝。實驗發(fā)現(xiàn)，在不同的條件下，離體線粒體的能量代謝曲線表現(xiàn)出差異性，通過計算所獲得的新陳代謝速率常數(shù)也呈現(xiàn)出與理論相符的規(guī)律。增加線粒體濃度、加入線粒體呼吸底物、加入細胞第二信使Ca2+，都能促進線粒體的代謝。而幾種呼吸鏈抑制劑則都表示出對線粒體能量代謝的抑制作用。同時，由于不同緩沖液中組分不同，線粒體的能量代謝也體現(xiàn)出了差異，這為探索藥物對不同條件下線粒體的影響提供了實驗基礎。以上實驗結果顯示了已報道的藥物功效與線粒體體外實驗的一致性，證明了微量熱實驗的可行性和優(yōu)良性，補充了體外檢測線粒體手段的不足，為線粒體的研究提供了有效的方法。

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