戴明君，潘 宏*

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院，安徽 安慶 246003）

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee Osteoarthritis，KOA)是以關(guān)節(jié)軟骨變性、軟骨下骨形成等病理改變?yōu)橹?，常伴有關(guān)節(jié)半月板退變，其中以內(nèi)側(cè)半月板的中央?yún)^(qū)退變程度最重，故本研究選擇該區(qū)域的半月板作為研究對(duì)象。退變的半月板對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生剪切、磨損，造成軟骨的正常壓力分布改變，最終加重關(guān)節(jié)軟骨的變性、壞死，所以研究半月板退變機(jī)理對(duì)于KOA疾病預(yù)防和延緩其進(jìn)展有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)退變的半月板生物大分子的表達(dá)情況研究，探討半月板退變的初步機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 臨床資料和標(biāo)本來(lái)源

以2016年1月～2017年1月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院骨科全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的晚期KOA患者16例作為實(shí)驗(yàn)組，其年齡為66.25±7.86歲，男性6例，女性10例；選擇同期收治的下肢毀損傷而截肢的患者5例作為對(duì)照組，其年齡為42.20±8.58歲，男性2例，女性3例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）晚期KOA，按美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的OA分類標(biāo)準(zhǔn)，全部符合KOA的診斷；（2）下肢毀損傷需要截肢的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾??；（2）術(shù)前兩周內(nèi)口服激素、非甾體鎮(zhèn)痛藥等；（3）術(shù)前四周內(nèi)關(guān)節(jié)內(nèi)注射激素等藥物；（4）伴有嚴(yán)重心腦肺等重要臟器疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

TNF-α、MMP-1及Ⅰ型膠原的免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、IPP6.0圖像分析軟件。

1.3 方法

1.3.1 半月板標(biāo)本收集

收集相應(yīng)患者的內(nèi)側(cè)半月板的中央?yún)^(qū)組織，并置-80℃下保存。

1.3.2 HE染色

1.3.3 MMP-1、TNF-α及Ⅰ型膠原免疫組化染色

具體步驟參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.4 結(jié)果觀察

1.3.4.1 半月板退變組織學(xué)評(píng)分

采用李國(guó)軍等制定的半月板退變的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.3.4.2 MMP-1、TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞百分率及Ⅰ型膠原染色灰度值

每個(gè)標(biāo)本取2張切片，每張切片光學(xué)顯微鏡下放大100倍，半月板的上下兩層各隨機(jī)選取3個(gè)視野。陽(yáng)性細(xì)胞百分率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，所有結(jié)果均取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用

采用SPSS Statistics 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得計(jì)量數(shù)值用±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組資料比較采取t檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)分析探討半月板退變組織學(xué)評(píng)分與免疫組化結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本大體

對(duì)照組半月板表面光滑，平整，亮白色，彈性好；實(shí)驗(yàn)組表面粗糙，淡黃色，彈性較差，有破裂缺損。

2.2 HE染色

對(duì)照組纖維軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞分布規(guī)律。膠原纖維豐富，纖維束粗大，排列整齊。實(shí)驗(yàn)組纖維軟骨細(xì)胞明顯減少，排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則。膠原纖維粗細(xì)不均，排列稀疏而紊亂。

2.3 半月板組織學(xué)評(píng)分及免疫組化染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組的半月板退變組織學(xué)評(píng)分及TNF-α、MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原的灰度值顯著低于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

2.3 相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)組半月板退變組織學(xué)評(píng)分與TNF-α、MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞百分率為正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)組半月板退變組織學(xué)評(píng)分與Ⅰ型膠原的灰度值為負(fù)相關(guān)。詳見(jiàn)表2。

表1 兩組半月板退變組織評(píng)分及免疫組化結(jié)果（x±s）

表2 免疫組化結(jié)果與半月板退變組織學(xué)評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

3.1 KOA病程中半月板病理改變

KOA除了關(guān)節(jié)軟骨病變、軟骨下骨形成外，常伴有半月板的退變。退變的半月板可表現(xiàn)為半月板表面的磨損、破裂、彈性減退等。本研究中KOA患者半月板表面粗糙，表面可見(jiàn)裂隙形成，光鏡下可以看到軟骨細(xì)胞明顯減少，排列不規(guī)則。膠原纖維粗細(xì)不均，排列稀疏。David等[2]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也有類似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)造模的狗半月板發(fā)生退變，其表面磨損，撕裂，膠原纖維及軟骨細(xì)胞變性壞死，隨著時(shí)間的推移這一變化加重。

3.2 半月板退變機(jī)理的初步研究

本研究結(jié)果顯示KOA患者半月板中TNF-α和MMP-1表達(dá)都較對(duì)照組顯著升高，而I型膠原分布明顯少于對(duì)照組。說(shuō)明半月板的退變可能與這些生物大分子表達(dá)有關(guān)。趙甲軍等[3]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示退變的半月板中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)明顯增多。有學(xué)者報(bào)道稱退變的半月板中TNF-α表達(dá)增多，并認(rèn)為TNF-α可以通過(guò)直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)MMPs、蛋白聚糖酶等表達(dá)致使細(xì)胞死亡、膠原纖維的降解，最終導(dǎo)致半月板的退變。I型膠原是半月板的主要膠原纖維成分，它的減少說(shuō)明纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞失去基質(zhì)的支持和保護(hù)，使其更易受到理化因素影響。

本研究通過(guò)研究幾種分子的表達(dá)情況與半月板退變組織評(píng)分關(guān)系，表明半月板的退變與TNF-α、MMP-1及I型膠原的表達(dá)可能存在一定關(guān)聯(lián)性。國(guó)外有報(bào)道稱，TNF-α等致炎因子表達(dá)異常增高，刺激MMP-1表達(dá)，從而造成軟骨及膠原纖維的破壞[4]。

3.3 研究半月板退變對(duì)于KOA治療的臨床意義

由于退變的半月板會(huì)加重關(guān)節(jié)軟骨的退變，而半月板的退變也隨KOA疾病進(jìn)程其退變程度逐漸加重。有學(xué)者認(rèn)為KOA的進(jìn)展和半月板的退變是一個(gè)相互促進(jìn)的過(guò)程，這最終導(dǎo)致KOA病情的持續(xù)惡化[5]。因此，研究半月板退變的機(jī)理，通過(guò)減少或者增強(qiáng)某種分子的表達(dá)，已達(dá)到阻斷某個(gè)中間環(huán)節(jié)，這對(duì)于KOA的治療提供一個(gè)新的思路。目前已經(jīng)有很多學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究。婁葦葦?shù)萚6]通過(guò)對(duì)小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TNF-α單抗（阿達(dá)木單抗），明顯減輕小鼠關(guān)節(jié)炎引起的炎癥浸潤(rùn)和軟骨破壞。但是這些研究多是通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)過(guò)程已達(dá)到延緩KOA進(jìn)展，且目前多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，而對(duì)于如何減少M(fèi)MP-1表達(dá)或者促進(jìn)膠原纖維形成以及它們對(duì)退變的半月板的影響研究很少報(bào)道，這可能是我們未來(lái)研究的新方向。

3.4 總結(jié)

總之，本課題結(jié)果顯示在KOA患者的半月板退變程度明顯高于正常的患者，而且在這些半月板中TNF-α、MMP-1表達(dá)明顯升高，I型膠原的含量明顯減少，這提示半月板的退變可能與TNF-α、MMP-1、I型膠原的表達(dá)情況存在一定關(guān)系。

[1] 李國(guó)軍,李康華,朱 勇,等.兔前交叉韌帶斷裂后外側(cè)半月板的組織學(xué)退變[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(20):3873-3876.

[2] David K,Daniel M,John M,et al.Meniscus Induced Cartilaginous Damage and Non-linear Gross Anatomical Progression of Earlystage Osteoarthritis in a Canine Mode[J].The Open Orthopaedics Journal, 2016, 10, 690-705.

[3] 趙甲軍,黃遂柱.兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎半月板形態(tài)改變及基質(zhì)金屬蛋白酶-3和金屬蛋白酶組織抑制劑-1表達(dá)[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2015,29(6):546-548.

[4] Okamoto K,Kiga N,Shinohara Y,et al.Effect of interleukin-1 beta and dehydropiandroster-one on the expression of lumican and fibromodulin in fibroblast-like synovial cells of the human temporomandibular joint[J].Eur J Histochem.2015,59(1):30-38.

[5] 林子洪,何愛(ài)珊,傅 明.前交叉韌帶切除后半月板變化及α2-巨球蛋白干預(yù)效果的初步研究[J].中華關(guān)節(jié)外科雜志,2010,14(1):93-99.

[6] 婁葦葦,杜曉楠,袁慧慧.靶向于TNF-α和RANKL的人源化抗體對(duì)DBA/1小鼠單關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2017,2(45):8-16.