杜寶香+相美容+付業(yè)佩+蔣海強(qiáng)+鞏麗麗+容蓉

[摘要] 由于中藥多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、相對(duì)分子質(zhì)量大，難以表征，該研究以中藥北沙參40%乙醇沉淀多糖（Glehniae Radix polysaccharides， RGP）為研究對(duì)象，應(yīng)用“自下而上”法完成對(duì)RGP的結(jié)構(gòu)表征。該文最初采用部分酸水解方法水解RGP，分別考察了酸濃度、水解時(shí)間和溫度對(duì)其水解效率的影響。在最佳條件（1.5 mol·L-1 TFA， 4 h， 80 ℃）下，RGP被水解為特征性寡糖片段。之后，采用HILIC-LC-MS對(duì)RGP部分酸水解產(chǎn)物進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)表征。同時(shí)結(jié)合幾種標(biāo)準(zhǔn)二糖的MS和MS/MS分析，建立依靠質(zhì)譜分析確定多糖糖苷鍵類型的方法。結(jié)果確定了4種糖苷鍵連接類型在MS/MS中的斷裂規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)RGP為含有1， 4-糖苷鍵的線性葡聚糖，水解得到聚合度4～11的葡寡糖。

[關(guān)鍵詞] 部分酸水解； 質(zhì)譜； 親水作用色譜； 北沙參多糖

[Abstract] Water-soluble polysaccharides from traditional Chinese medicine have properties of complex structure and high molecular， resulting in hardly complete their structural characterization.However， a "bottom-up" approach could solve this problem.Glehniae Radix extract was extracted with hot water and then precipitated by 40% ethanol to obtain Glehniae Radix polysaccharides （RGP）. Subsequently， a partial acid hydrolysis method was carried out and the effects of acid concentration， time and temperature on hydrolysis were investigated. Under the optimum hydrolysis condition （1.5 mol·L-1 trifluoroacetic acid， 4 h， and 80 ℃）， RGP were hydrolyzed to characteristic oligosaccharide fragments. Futher， a hydrophilic liquid chromatography- mass spectrometry method was used for the separation and structural characterization of the polysaccharide hydrolysates. According to MS and MS/MS analysis of several standard disaccharides， a method for determining the type of polysaccharide glycosidic linkage by mass spectrometry was established. The results showed that the polysaccharide hydrolysates were linear glucan containing 1， 4-glycosidic bonds. And gluco-oligosaccharides with the degrees of polymerization （DP） of 4-11 were obtained after partial acid hydrolysis.

[Key words] partial acid hydrolysis； mass spectrometry； hydrophilic liquid chromatography； Glehniae Radix polysaccharides

北沙參Glehniae Radix為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidtex Miq的干燥根。味甘、微苦、性微寒，歸肺、胃經(jīng)，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效[1]。研究表明，北沙參主要含有揮發(fā)油類、香豆素類及糖類等成分[2]，作為北沙參的主要成分之一，北沙參總糖量達(dá)70%以上[3]，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、消除自由基以及抗癌抗腫瘤等[4-5]方面發(fā)揮著重大作用。

多糖的活性與其單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量、糖苷鍵位置及構(gòu)型等因素相關(guān)?？刹捎霉庾V及色譜方法分析中藥多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行表征[6]。獲取結(jié)構(gòu)信息是表征多糖的有效手段，但此過程復(fù)雜、繁瑣、需要耗費(fèi)大量精力。因此，有必要發(fā)展一種簡(jiǎn)潔、省時(shí)的方法用于中藥多糖的表征。

北沙參40%乙醇沉淀多糖（Glehniae Radix polysaccharides，RGP）為混合雜多糖，受蛋白質(zhì)組學(xué)“自下而上”法的啟示，對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以表征的大分子物質(zhì)，可先將其拆分成相對(duì)分子質(zhì)量較小的片段，通過對(duì)各片段結(jié)構(gòu)的分析，進(jìn)而完成對(duì)該物質(zhì)的表征。本文首先采用部分酸水解方法將RGP降解為特征性寡糖片段，之后，使用親水作用色譜以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法完成對(duì)寡糖片段的分離及表征研究，進(jìn)而獲取RGP的組成、連接方式等結(jié)構(gòu)信息。同時(shí)研究了不同類型糖苷鍵在MS/MS分析中的裂解規(guī)律。該法可直觀反映出多糖成分中糖單元的個(gè)數(shù)、組成及比例分布等信息。

1 材料

北沙參藥材購(gòu)于山東省濟(jì)南市百味堂中藥飲片有限公司（批號(hào)140301，山東萊陽(yáng)），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為傘形科植物珊瑚菜G.littoralis的干燥根。三氟乙酸（TFA，純度> 99.0%），購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；實(shí)驗(yàn)用水購(gòu)自廣州屈臣氏有限公司；乙腈、甲酸（色譜純）購(gòu)自Fisher Scientific（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。endprint

Agilent 1260 系列高效液相色譜儀（配有在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Agilent G4260B蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），美國(guó)Agilent公司）；Q Exactive 型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；UltiMate 3000高相液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 RGP的制備

取北沙參藥材1 000 g，粉碎，加入6倍體積的80%乙醇回流提取2次，每次2 h，抽濾，藥渣自然晾干至無(wú)醇味。取藥渣500 g，按照工藝優(yōu)化中的最佳提取工藝[7]：加入25倍量蒸餾水，94.9 ℃條件下浸提2次，每次2 h，過濾，離心，上清液濃縮至600 mL，得北沙參多糖熱水浸提液。加入適量的無(wú)水乙醇，用酒精計(jì)測(cè)量乙醇濃度，控制在40%，于4 ℃冰箱靜置24 h，抽濾得沉淀，分別用少量無(wú)水乙醇和丙酮洗滌2～3次，冷凍干燥，得RGP。

2.2 RGP部分酸水解條件的優(yōu)化[8]

稱取10 mg RGP于具塞試管中，分別考察水解時(shí)間、溫度及酸濃度對(duì)水解程度的影響。

水解時(shí)間分別設(shè)為1，2，3，4，5 h（TFA濃度為1.5 mol·L-1，溫度為80 ℃）；水解溫度分別設(shè)為30，40，60，80，100 ℃（TFA濃度為1.5 mol·L-1，時(shí)間為4 h）；酸濃度分別設(shè)為0.5，1，1.5，2，2.5 mol·L-1（溫度為80 ℃，時(shí)間為4 h），水解液氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈-水（50∶50）溶液溶解，過0.22 μm濾膜，供HILIC HPLC-ELSD分析。

2.3 分析條件

2.3.1 HILIC HPLC-ELSD分析條件 色譜柱為Agilent HILIC柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent公司）。流動(dòng)相A為水，B為乙腈；洗脫梯度0～20 min，85%～75% B；21～28 min，60% B；流速0.3 mL·min-1；柱溫室溫；進(jìn)樣量3 μL。ELSD參數(shù)：漂移管溫度70 ℃；霧化器溫度60 ℃；增益10；載氣氮?dú)?；流?.2 L·min-1。

2.3.2 HILIC LC-MS聯(lián)用條件 色譜柱Agilent HILIC柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent公司）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；洗脫梯度0～ 20 min，80%～60% B，20～25 min，60% B；流速0.2 mL·min-1；負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3.2 kV；鞘氣流30 arb；輔助氣流10 arb；質(zhì)譜掃描范圍m/z 150～2 000；毛細(xì)管溫度300 ℃；MS/MS裂解電壓為50，60，70 V。

2.4 樣品溶液的測(cè)定

取2.2項(xiàng)不同水解條件下的樣品溶液，按照2.3.1項(xiàng)色譜條件分析，用于水解條件的優(yōu)化選擇。

根據(jù)優(yōu)化后的水解條件，制備RGP水解溶液，按照2.3.2項(xiàng)條件進(jìn)行HILIC LC-MS 分析；取4種二糖（海藻糖、蜜二糖、纖維二糖、蔗糖）適量，加入乙腈-水（50∶50）溶解，配成一定濃度的對(duì)照品溶液，按照2.3.2項(xiàng)條件進(jìn)行HILIC LC-MS分析，用于建立不同糖苷鍵連接類型二糖在質(zhì)譜中的斷裂規(guī)律。

3 結(jié)果與討論

3.1 北沙參多糖部分酸水解方法的建立

使用“熱水浸提、乙醇沉淀”法對(duì)北沙參藥材進(jìn)行處理，得北沙參40%乙醇沉淀多糖RGP。為得到北沙參特征性寡糖片段，對(duì)于影響水解過程的水解時(shí)間、溫度以及酸濃度進(jìn)行了深入研究。

水解之后的多糖采用HILIC HPLC-ELSD進(jìn)行分析。結(jié)果表明，RGP在HILIC色譜柱上得到較好的分離，根據(jù)分子量由小到大順序依次被洗脫出來。不同溫度下RGP的水解情況，前2 min色譜峰為水解出的單糖及一些雜質(zhì)，2～8 min為寡糖成分，26 min左右為未被水解的北沙參多糖，見圖1。30 ℃時(shí)，由于溫度較低，水解不夠充分，大多數(shù)以多糖形式存在；80 ℃時(shí)，RGP全部水解成單糖及寡糖；當(dāng)溫度增至100 ℃，多糖水解程度隨之增加，寡糖幾乎全都水解為單糖物質(zhì)。因此，為得到特征性寡糖片段，最佳水解溫度設(shè)為80 ℃。

以各寡糖峰峰面積之和為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)水解時(shí)間及酸濃度進(jìn)行分析，見圖2，3。隨著水解時(shí)間和酸濃度的增加，寡糖含量均先上升后降低。水解開始時(shí)，大分子多糖迅速水解為寡糖，寡糖含量急劇升高；隨著水解程度的增加，部分寡糖水解為分子量更小的單糖，其含量開始降低。為得到較高含量的特征性寡糖，分別取4 h，1.5 mol·L-1為最佳水解時(shí)間和酸濃度。

3.2 4種標(biāo)準(zhǔn)二糖的HILIC-MS和MS/MS分析

選擇4種結(jié)構(gòu)確定的二糖：海藻糖、蜜二糖、纖維二糖、蔗糖分別代表4種不同糖苷鍵類型。4種二糖的相對(duì)分子質(zhì)量均為342，因此它們?cè)贛S分析時(shí)沒有差異，但對(duì)于不同糖苷鍵鏈接的寡糖，在MS/MS分析時(shí)，具有不同的斷裂規(guī)律及質(zhì)量丟失不同。4種二糖的MS/MS圖顯示1，1-糖苷鍵的海藻糖在MS/MS中出現(xiàn)m/z 323，221，179，161的碎片質(zhì)譜峰，分別為母離子341丟失18，120，162，180形成的碎片，其中18為H2O的失去，162為糖殘基（C6H10O5）丟失，180（C6H12O6）為丟失162之后再丟失1分子的H2O。其他二糖的MS/MS中除上述外，還有其他質(zhì)量丟失，見表1。

綜合4種二糖在負(fù)離子模式下的MS/MS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①糖苷鍵連接位點(diǎn)的不同會(huì)導(dǎo)致相對(duì)質(zhì)量丟失的不同，見表1；②除從結(jié)構(gòu)上直接斷裂導(dǎo)致的相對(duì)質(zhì)量丟失（162，120，90，60，30），同時(shí)存在脫水所導(dǎo)致的相對(duì)質(zhì)量丟失（18，78，180 ）；③糖殘基能完整斷裂說明其斷裂位置一定為非1C位的糖苷鍵位點(diǎn)，見圖4。endprint

3.3 RGP HILIC LC-MS及MS/MS表征方法的建立

北沙參多糖經(jīng)過部分酸水解后得到大量特征性寡糖片段，采用HILIC LC-MS在負(fù)離子模式下對(duì)其進(jìn)行分析，寡糖片段的總離子流圖（TIC）見圖5。對(duì)圖5質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，2 min前為雜質(zhì)峰，包括單糖、二糖及提取物中其他雜質(zhì)，寡糖在2～10 min按聚合度由低到高依次出現(xiàn)，色譜峰1～8對(duì)應(yīng)寡糖1～8的相對(duì)分子質(zhì)量分別為666，828，990，1 152，1 314，1 476，1 638，1 800。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]分析，色譜峰1～8依次為聚合度（DP）4～11的中性葡寡糖，因此，本文提取得到的RGP主要被水解為聚合度4～11的葡寡糖。

以聚合度為6的寡糖（色譜峰3）為例，其在負(fù)離子模式下的MS/MS信息見圖6，對(duì)其二級(jí)質(zhì)譜規(guī)律進(jìn)行分析見圖7。以[M-H]-為母離子，丟失葡萄糖殘基（162）形成一系列C型碎片，m/z 179（C1），341（C2），503（C3），665（C4），827（C5）。一系列完整的C型碎片證明寡糖結(jié)構(gòu)為線性[9]。同時(shí)，[M-H]-發(fā)生開環(huán)斷裂，丟失120，形成一些列2，4A型碎片，m/z 221（2，4A2），383（2，4A3），545（2，4A4）， 707（2，4A5），869（2，4A6）；或者丟失78，即丟失60的同時(shí)丟失一分子水，形成一系列0，2A-H2O（B）型碎片，m/z 263（B2），425（B3），587（B4），749（B5），911（B6）。此外，在各寡糖的二級(jí)質(zhì)譜圖內(nèi)均出現(xiàn)了m/z 341，323，281，263，221，179，161的碎片離子質(zhì)譜峰，其斷裂規(guī)律符合1，4-糖苷鍵，故推測(cè)RGP可能為含有1，4-糖苷鍵的線性葡寡糖。

4 結(jié)論

本研究借鑒蛋白質(zhì)組學(xué)“自下而上”的方法，完成了對(duì)RGP的表征，直觀反映了多糖成分中糖單元的結(jié)構(gòu)、種類等信息。同時(shí)采用HILIC LC-MS聯(lián)用的方法研究不同糖苷鍵二糖在MS/MS分析時(shí)的斷裂規(guī)律。結(jié)果表明，提取得到的RGP水解后得到聚合度4～11的葡寡糖，為含有1，4-糖苷鍵的線性葡寡糖；發(fā)現(xiàn)了不同糖苷鍵二糖在MS/MS分析時(shí)的斷裂規(guī)律，建立了依靠質(zhì)譜分析快速明確糖苷鍵類型的方法。

本研究存在許多不足之處：糖類物質(zhì)因?yàn)榻M成和單位結(jié)構(gòu)的特殊性，其同分異構(gòu)體現(xiàn)象非常普遍，單單依靠質(zhì)譜檢測(cè)難以對(duì)糖類成分進(jìn)行定性定量研究，難以確定多糖的具體結(jié)構(gòu)。由于部分酸水解方法的局限性，難以確定多糖中是否存在除1，4-糖苷鍵以外的其他類型的糖苷鍵。之后的研究將對(duì)北沙參多糖基于不同類型糖苷鍵水解酶作用下酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint