趙筱萍+余韞如+李雪+邵青+王益民+趙濤+趙超+趙步長(zhǎng)+王躍飛+王毅

[摘要] 腦心同治理論是基于中醫(yī)傳統(tǒng)理論并結(jié)合臨床實(shí)踐發(fā)展而來(lái)，該文提出了在腦心同治理論基礎(chǔ)上，構(gòu)建中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)的思路，包括腦心同治網(wǎng)絡(luò)建模、藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)、作用機(jī)制研究以及腦心同治方藥體內(nèi)過(guò)程研究等。該文以腦心同治網(wǎng)絡(luò)建模為例，采用數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)搜索收集疾病相關(guān)基因，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析，最終發(fā)現(xiàn)心、腦血管疾病相關(guān)的關(guān)鍵生物過(guò)程包括氧化應(yīng)激、代謝、炎癥等，其中GSK3B，NOTCH1，CDK4等基因占據(jù)網(wǎng)絡(luò)子簇中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用該研究平臺(tái)，獲得了丹紅注射液主要成分調(diào)控的生物分子網(wǎng)絡(luò)模型，從而發(fā)掘其治療心腦血管疾病的共有靶點(diǎn)與作用途徑。其中，GSK3B在網(wǎng)絡(luò)中與丹紅注射液成分相關(guān)性最多，且其所在的子簇涉及到的生物功能有細(xì)胞氧化應(yīng)激。根據(jù)分析結(jié)果，在氧化損傷心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞模型上驗(yàn)證了丹紅注射液可顯著提高氧化損傷后心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞的存活率，其保護(hù)機(jī)制與提高GSK3β蛋白磷酸化水平有關(guān)，且丹參與紅花配伍具有協(xié)同效應(yīng)。以上結(jié)果顯示，采用網(wǎng)絡(luò)建模等方法，可研究揭示丹紅注射液等腦心同治方藥治療心腦血管疾病的作用機(jī)制。該研究提出的中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)框架，為綜合運(yùn)用現(xiàn)代科技手段科學(xué)揭示“腦心同治”的機(jī)制提供了可行途徑。

[關(guān)鍵詞] 腦心同治； 丹紅注射液； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 氧化應(yīng)激

[Abstract] The Concurrent treatment of the brain and heart （CTBH） theory is proposed based on traditional Chinese medical theory and clinical practice. In this study， a framework for the pharmacological research platform was established to investigate the principles of concurrent treatment of the brain and heart. The platform for CTBH includes several key techniques for network modeling， discovery of active substances， dissecting mechanism of action and investigation of pharmacokinetic property of TCM. Taking network modeling of CTBH as an example， using database search， literature mining， network construction and module analysis， the that network modules closely associated with the pathological progress of cardiovascular and cerebrovascular diseases were identified， while further functional enrichment analysis of these modules indicated that the key biological processes included oxidative stress， metabolism and inflammation. GSK3B， NOTCH1， CDK4 were identified as key nodes in these network modules. The above-mentioned platform was applied to construct component-biomolecules network of Danhong injection for the identification of common targets and pathways. Among them， GSK3B had the highest correlation with the composition of Danhong injection in the network， and the biological function of whose cluster was related to cell oxidative stress. Based upon results of network analysis， validation experiments suggested that Danhong injection significantly improved the survival rate of oxidative injured myocardial cells and nerve cells， and the protective effect was related to the increase of phosphorylated GSK3β protein expression. Moreover， extracts of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Carthami Flos exerted the synergisticcytoprotective effect. The results indicated that the mechanism of treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases of Danhong injection could be studied through network modeling and other methods. In summary， the proposed pharmacological platform provided a feasible way for revealing the mechanism of CTBH by using modern scientific methods.endprint

[Key words] Concurrent treatment of the brain and heart； Danhong injection； network pharmacology； oxidative stress

“腦心同治”理論是基于中醫(yī)異病同治理念和中醫(yī)整體觀并結(jié)合臨床實(shí)踐發(fā)展而來(lái)[1]。中醫(yī)典籍記載，“心者，君主之寶”；“腦為元神之府”。臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，導(dǎo)致心之脈絡(luò)受損、氣血逆亂，出現(xiàn)痰熱壅阻、瘀血內(nèi)阻等證候，臨床表現(xiàn)為胸痹、中風(fēng)[2]。近代中醫(yī)學(xué)家結(jié)合醫(yī)學(xué)發(fā)展，總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，提出心腦共主神明，為腦心同治奠定了基礎(chǔ)。盡管心腦血管疾病的病因病機(jī)較為復(fù)雜，但本虛標(biāo)實(shí)是其共有特征，心腎陽(yáng)氣虧虛為本，痰濁、瘀血阻滯為標(biāo)，均可歸為氣虛血瘀證。以益氣活血、化瘀通絡(luò)之法可實(shí)現(xiàn)腦心同治[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，心、腦血管疾病主要是血管動(dòng)脈粥樣硬化或血栓形成引發(fā)心、腦等器官缺血事件，動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈以及外周動(dòng)脈疾病的主要病理過(guò)程[4]。因此，臨床常采用控制血壓、調(diào)血脂、抗血小板聚集、抗血栓等多種類型藥物進(jìn)行綜合防治。盡管心、腦血管疾病具有共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，然而由于其涉及病理環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，如何開(kāi)展中藥腦心同治的藥理機(jī)制研究尚缺乏較完整的方法體系。

丹紅注射液是由丹參、紅花提取而成，具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)等作用，用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)，證見(jiàn)：胸痛，胸悶，心悸，口眼歪斜，言語(yǔ)蹇澀，肢體麻木，活動(dòng)不利等癥；冠心病、心絞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性腦病、腦血栓。臨床上，丹紅注射液對(duì)腦梗死、冠心病、心絞痛、心肌梗死的治療具有顯著效果[5-8]。藥理學(xué)研究表明，丹紅注射液具有抑制血小板聚集、抗炎癥損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗細(xì)胞凋亡等多方面藥理作用[9]。

本文提出了中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)的框架，以丹紅注射液為例，運(yùn)用該平臺(tái)獲得了丹紅注射液主要成分調(diào)控的生物分子網(wǎng)絡(luò)，從而發(fā)掘其治療心、腦血管疾病的共有靶點(diǎn)與作用途徑。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，在氧化損傷心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞模型上驗(yàn)證了丹紅注射液可提高氧化損傷心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞的存活率，并以實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹紅注射液能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)GSK3β蛋白的表達(dá)與磷酸化水平。

1 中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)框架

中醫(yī)治病講究辨證論治，注重從整體把握病因、病機(jī)以及病癥的系統(tǒng)變化，以對(duì)機(jī)體功能狀態(tài)做出綜合判斷。腦心同治理論將心、腦血管疾病防治的基礎(chǔ)與臨床，綜合與分析，宏觀與微觀，實(shí)體本體與關(guān)系本體鏈接起來(lái)，突出臨床、重在實(shí)用，體現(xiàn)了腦心同治方藥多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)體生物分子網(wǎng)絡(luò)的作用特點(diǎn)。因此，中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)著重研究揭示中藥作用于心腦血管系統(tǒng)的過(guò)程與機(jī)制，包括了腦心同治網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、藥效物質(zhì)的篩選發(fā)現(xiàn)、藥效物質(zhì)對(duì)機(jī)體的作用機(jī)制研究以及機(jī)體對(duì)藥效物質(zhì)的處置過(guò)程，從而闡明腦心同治的科學(xué)原理，指導(dǎo)中藥臨床應(yīng)用。據(jù)此，中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)包括腦心同治生物分子網(wǎng)絡(luò)建模、腦心同治藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)、腦心同治作用機(jī)制研究以及體內(nèi)過(guò)程研究等4項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，見(jiàn)圖1。

1.1 腦心同治生物分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建技術(shù) 網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)研究可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)建模與網(wǎng)絡(luò)分析等方法來(lái)系統(tǒng)認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中機(jī)體生物分子網(wǎng)絡(luò)的變化規(guī)律[10]。網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)的默認(rèn)假設(shè)為網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與節(jié)點(diǎn)連接度的變化與疾病進(jìn)程有關(guān)。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)研究方法，可系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)疾病影響的關(guān)鍵生物分子模塊以及關(guān)鍵蛋白，從而為疾病預(yù)防、治療、預(yù)后以及藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)提供了新的研究思路。

運(yùn)用這一國(guó)際前沿研究手段，筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和文獻(xiàn)挖掘，獲得心腦血管疾病相關(guān)的基因、蛋白等生物分子信息，并依據(jù)蛋白質(zhì)相互關(guān)系可構(gòu)建出腦心同治相關(guān)生物分子網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行子簇分析與功能富集，找出與心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)模塊與關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用于丹紅注射液作用機(jī)制研究時(shí)，獲取丹紅注射液中主要化學(xué)成分調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，并進(jìn)一步構(gòu)建丹紅注射液成分-生物分子網(wǎng)絡(luò)模型。此外，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證丹參提取物、紅花提取物、丹紅注射液對(duì)氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。本文后續(xù)將詳細(xì)介紹腦心同治生物分子網(wǎng)絡(luò)建模與網(wǎng)絡(luò)分析的研究方法與結(jié)果。

1.2 中藥腦心同治藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)技術(shù) 研究發(fā)現(xiàn)腦心同治藥效物質(zhì)，一方面可用現(xiàn)代語(yǔ)言解釋中藥防治心腦血管疾病的機(jī)制，另一方面也為詮釋腦心同治理論提供科學(xué)依據(jù)。由于心、腦血管疾病發(fā)生發(fā)展影響因素復(fù)雜，涉及細(xì)胞組織類型眾多，因此，需要采用多層次多途徑模型來(lái)篩選發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)。本研究前期采用模式生物、組織、細(xì)胞等多種藥理模型，辨識(shí)出丹紅注射液中丹參酚酸、紅花黃酮、有機(jī)酸等藥效物質(zhì)[11]。運(yùn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)血栓模型篩選發(fā)現(xiàn)迷迭香酸、對(duì)香豆酸等抗血栓活性成分[12]；在炎性刺激神經(jīng)細(xì)胞模型與氧化損傷心肌細(xì)胞模型上發(fā)現(xiàn)丹參酚酸B等神經(jīng)保護(hù)活性成分以及羥基紅花黃色素A等心肌保護(hù)活性成分[13]，從而為質(zhì)控指標(biāo)的合理選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

1.3 腦心同治作用機(jī)制研究技術(shù) 天津中醫(yī)藥大學(xué)朱彥教授等針對(duì)心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中血管效應(yīng)、血小板功能、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管新生、細(xì)胞黏附等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，揭示丹紅注射液依賴內(nèi)皮COX/PGI2途徑舒張血管；上調(diào)缺血組織CXCR4基因表達(dá)促進(jìn)血管新生，增加缺血區(qū)域毛細(xì)血管密度，恢復(fù)血流供應(yīng)；抑制COX-2表達(dá)，減少PGE2合成及IL-6等炎癥因子分泌，減輕系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[14]；多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體實(shí)現(xiàn)Ca2+動(dòng)員和cAMP信號(hào)通路的協(xié)調(diào)抑制作用，抑制血栓形成；拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷造成的神經(jīng)元凋亡，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元等作用，從而整體性闡明了丹紅注射液腦心同治的分子機(jī)制與藥理作用特點(diǎn)[15-17]。

1.4 腦心同治方藥體內(nèi)過(guò)程研究技術(shù) 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所李川研究員課題組圍繞丹紅注射液中主要活性成分的體內(nèi)過(guò)程開(kāi)展系統(tǒng)研究，建立了腦心同治方藥體內(nèi)過(guò)程研究技術(shù)，明確了丹紅注射液主要活性成分的體內(nèi)暴露水平與清除機(jī)制，比較了小鼠、大鼠、犬等不同種屬的代謝差異，特別是在健康人體監(jiān)測(cè)了丹紅注射液中主要活性成分的體內(nèi)過(guò)程[18]，從而全面揭示丹紅注射液主要活性成分的體內(nèi)分布、代謝與清除規(guī)律，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供了依據(jù)。endprint

2 腦心同治生物分子網(wǎng)絡(luò)研究

2.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及網(wǎng)絡(luò)建模方法 本研究所選擇的生物分子信息來(lái)源于數(shù)據(jù)庫(kù)與文獻(xiàn)，其中心血管疾病的相關(guān)基因來(lái)自CHD@ZJU V2.0[19]，并進(jìn)行去重修改、基因名與基因ID校對(duì)。腦血管疾病的相關(guān)基因來(lái)自DisGeNET[20]，SIDD[21]，MALACards[22-23]，Diseases Database（http：//diseases.jensenlab.org/Search），Disease and Gene Annotations （DGA）[24]等數(shù)據(jù)庫(kù)，以“brain ischemia”，“brain infarction”，“stroke”等10個(gè)關(guān)鍵詞搜索后獲得。文獻(xiàn)來(lái)源的生物分子信息來(lái)源于PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，以“brain ischemia”等6個(gè)關(guān)鍵詞檢索出文獻(xiàn)，并經(jīng)Pubtator[25]整理獲得相關(guān)基因，將數(shù)據(jù)庫(kù)與文獻(xiàn)信息整合為腦血管疾病相關(guān)基因。

將上述得到的心、腦血管疾病相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)后得到共有基因列表，將其輸入到string V10.0[26]（http：//string-db.org/）中獲得相對(duì)應(yīng)的蛋白以及整合后的蛋白-蛋白相互作用（PPI）關(guān)系，獲得共有基因間的相關(guān)關(guān)系，并采用Cytoscape v3.2.1[27]軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型。為了進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的功能模塊，采用Cytoscape中的插件MCODE[28]獲得該網(wǎng)絡(luò)的子簇，并對(duì)每個(gè)子簇進(jìn)行GO分析[29]（http：//geneontology.org/），選取P最小的第一級(jí)GO注釋以描述其涉及的生物功能。

2.2 心、腦血管疾病共有生物分子網(wǎng)絡(luò)模型 本研究得到心血管疾病相關(guān)基因有1 059個(gè)，腦血管疾病相關(guān)基因有989個(gè)。心、腦血管疾病共有相關(guān)基因492個(gè)。將該492個(gè)基因?qū)?yīng)的蛋白以及PPI關(guān)系提取出來(lái)，篩選出combined score≥0.95的PPI對(duì)，共計(jì)1 382對(duì)。通過(guò)Cytoscape軟件建立生物分子網(wǎng)絡(luò)模型后進(jìn)行子簇分析，得到12個(gè)子簇（cluster），將節(jié)點(diǎn)數(shù)大于3的子簇可視化，見(jiàn)圖2。這些子簇中生物分子所涉及的主要生物功能包括生殖發(fā)育、Cdc42蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞氧化應(yīng)激、環(huán)氧合酶途徑等，見(jiàn)表1，提示心、腦血管疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程與炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡、代謝等密切相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)子簇中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)按聚類系數(shù)以及連接度排序，結(jié)果見(jiàn)表2。排名前10的基因包括GSK3B，NOTCH1，CDK4，IL6，E2F1，CDKN2A，PTEN，MAPK3，CDKN1B，RAC1等。其中網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的節(jié)點(diǎn)為子簇4中的GSK3B基因，提示GSK3B相對(duì)應(yīng)的蛋白在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

3 丹紅注射液腦心同治生物分子網(wǎng)絡(luò)研究

3.1 丹紅注射液主要化學(xué)成分-生物分子網(wǎng)絡(luò)模型 依據(jù)已知丹紅注射液主要成分研究的結(jié)果[11， 30]，其主要有8種成分：丹參素（DSS）、丹酚酸A（SAA）、丹酚酸B（SAB）、迷迭 香酸（RA）、原兒茶醛（PA）、羥基紅花黃色素A（HSYA）、紫丁香苷（syringin）、p-香豆酸（PCA）。在GoPubMed[31]中對(duì)丹紅注射液主要化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)映射到子簇上，建立丹紅注射液主要化學(xué)成分-生物分子網(wǎng)絡(luò)模型，分析丹紅注射液對(duì)各個(gè)子簇的影響。

在所獲得的12個(gè)子簇中，成分相關(guān)基因有30個(gè)，根據(jù)每個(gè)基因與成分的連接數(shù)對(duì)基因節(jié)點(diǎn)大小進(jìn)行排序，見(jiàn)圖3。丹紅注射液成分與子簇1、3、4、6、7有關(guān)聯(lián)。其中，丹紅注射液成分與子簇1和子簇4關(guān)聯(lián)最多，與子簇1和子簇4關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)數(shù)≥3的丹紅注射液成分有丹參素、丹參酚酸B、羥基紅花黃色素等。子簇1功能主要與生殖發(fā)育相關(guān)；子簇4主要與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)。在所有子簇節(jié)點(diǎn)中，GSK3B、NFKB1所連接的丹紅注射液成分最多。鑒于共有網(wǎng)絡(luò)子簇中，GSK3B與其他基因連接度最高，說(shuō)明GSK3B在該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要位置，提示丹紅注射液可能作用于GSK3B調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)通路。

3.2 丹紅注射液對(duì)H2O2損傷H9c2，PC12細(xì)胞的保護(hù)作用研究 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，在過(guò)氧化氫損傷的H9c2心肌細(xì)胞以及PC12神經(jīng)細(xì)胞模型上驗(yàn)證丹紅注射液的抗氧化應(yīng)激活性。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（control）、模型組（300 mmol·L-1H2O2，損傷1.5 h）、丹紅注射液組（10 mL·L-1）、丹參提取物組（10 mL·L-1）以及紅花提取物組（10 mL·L-1）。模型組加入含300 mmol·L-1的H2O2的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。給藥組在給藥24 h后，按照模型組的方法進(jìn)行處理。對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)用含10% FBS的高糖DMEM或1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，Western blot法檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)。

結(jié)果顯示，與模型組存活率降低至65.80%相比，10 mL·L-1的紅花提取物、丹參提取物以及丹紅注射液預(yù)保護(hù)24 h可使氧化損傷后的心肌細(xì)胞存活率提高至82.30%，96.61%，118.67%，見(jiàn)圖4a，表明丹紅注射液具有顯著的抗氧化損傷活性，且丹參提取物與紅花提取物存在協(xié)同效應(yīng)。

與之類似，丹參提取物、丹紅注射液也能顯著提高氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞存活率，見(jiàn)圖4b。上述結(jié)果表明，抗氧化應(yīng)激是丹紅注射液腦心同治的機(jī)制之一。

采用Western blot方法檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)GSK3β的表達(dá)及磷酸化水平，結(jié)果見(jiàn)圖5。雙氧水損傷使H9c2心肌細(xì)胞p-GSK3β/G-SK3β明顯降低，而丹紅注射液能夠顯著提高p-GSK3β/G-SK3β水平，且其活性優(yōu)于丹參提取物與紅花提取物。在氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞模型上，也發(fā)現(xiàn)丹紅注射液在一定程度上能恢復(fù)p-GSK3β/G-SK3β水平。該驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)建模與網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果，即丹紅注射液通過(guò)調(diào)控GSK3B相關(guān)生物分子，產(chǎn)生抗細(xì)胞氧化應(yīng)激活性，從而實(shí)現(xiàn)腦心同治的藥理作用。endprint

4 討論

本研究提出了中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)的框架，構(gòu)建了心、腦血管疾病共有相關(guān)生物分子網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)分析丹 紅注射液主要成分與子簇基因?qū)?yīng)的蛋白之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液可對(duì)網(wǎng)絡(luò)子簇1與子簇4的生物分子進(jìn)行調(diào)控，且丹紅注射液中不同化學(xué)結(jié)構(gòu)類型成分可調(diào)控多個(gè)網(wǎng)絡(luò)模塊中的生物分子，這表明了不同成分之間多靶點(diǎn)協(xié)同作用，出現(xiàn)多成分-多靶點(diǎn)作用的效應(yīng)。

網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液主要對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、發(fā)育、免疫、氧化應(yīng)激、細(xì)胞遷移等方面進(jìn)行調(diào)控。并推測(cè)出丹參素主要對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞遷移等進(jìn)行影響，而丹酚酸B和迷迭香酸主要對(duì)細(xì)胞凋亡、發(fā)育、氧化應(yīng)激等進(jìn)行調(diào)控，羥基紅花黃色素A主要作用于氧化應(yīng)激等生物過(guò)程。根據(jù)2張網(wǎng)絡(luò)的對(duì)比，推測(cè)GSK3β可能是在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及丹紅注射液治療中比較關(guān)鍵的蛋白之一，并對(duì)此進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與目前的文獻(xiàn)報(bào)道基本相符合[32-35]。GSK3β促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，并可維持心肌細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)，失去對(duì)GSK3β的控制可導(dǎo)致機(jī)體死亡[35]。持續(xù)抑制GSK3β引起心肌代償性肥大，抑制凋亡和纖維化，并增加心肌收縮力[34]。同時(shí)，GSK3β參與代謝紊亂和腦缺血損傷的調(diào)節(jié)[32]。D′Angelo等報(bào)道，磷酸化的GSK3β與腦缺氧缺血的神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)[33]。Kim等[34]曾報(bào)道，雙氧水對(duì)H9c2心肌細(xì)胞損傷后，減少了GSK3β的磷酸化。Nair等[36]也曾報(bào)道，雙氧水誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷會(huì)引起GSK3β的去磷酸化。在氧化應(yīng)激損傷下，對(duì)GSK3β磷酸化進(jìn)行恢復(fù)，可能在“腦心同治”中具有重要意義。

除了丹紅注射液，腦心通、復(fù)方丹參滴丸等中成藥也常被用于治療心腦血管疾病。本文所提出的“腦心同治”藥理學(xué)研究平臺(tái)，可用于這類腦心同治方藥作用研究，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)模塊分析，找出不同類型化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)和主要調(diào)控的信號(hào)通路以及功能模塊，為進(jìn)一步深入探討藥理作用機(jī)制、明確此類中成藥的臨床定位提供科學(xué)依據(jù)。

陳迪等[37-38]曾報(bào)道基于數(shù)據(jù)科學(xué)的“腦心同治”分子機(jī)制研究，采用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和有效化合物信息收集，對(duì)比2個(gè)疾病相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的不同結(jié)果進(jìn)行分析。本文采用了數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，在2種不同細(xì)胞系上驗(yàn)證了丹紅注射液對(duì)氧化損傷心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。其中，丹紅注射液抗氧化損傷機(jī)制與GSK3β蛋白磷酸化的關(guān)系為首次發(fā)現(xiàn)。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析得到GSK3β在丹紅注射液治療心、腦血管疾病中可能起到關(guān)鍵作用，為丹紅注射液“腦心同治”作用機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)。

氧化應(yīng)激反映了機(jī)體活性氧的產(chǎn)生與抗氧化能力的失衡?；钚匝醢ǔ蹶庪x子自由基（O2-）、羥基（-OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）[39]。已有研究表明，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，與心、腦血管疾病均密切相關(guān)[40-41]。GSK3家族最初被鑒定為糖原合酶的負(fù)調(diào)節(jié)劑，而糖原合酶是糖原合成中的限速酶[42]。實(shí)驗(yàn)表明，丹紅注射液對(duì)GSK3β蛋白磷酸化具有一定影響，可能通過(guò)恢復(fù)GSK3β的磷酸化以保護(hù)心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞在H2O2刺激下的損傷。上述研究表明，丹紅注射液可通過(guò)抑制GSK3β介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生心肌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，這對(duì)于解釋丹紅注射液腦心同治的分子機(jī)制提供了科學(xué)證據(jù)。

中藥腦心同治藥理學(xué)研究平臺(tái)的建立，不僅對(duì)于明確腦心同治方藥的臨床作用特點(diǎn)、指導(dǎo)臨床定位和合理用藥具有重要意義，同時(shí)也為確定質(zhì)控指標(biāo)、設(shè)計(jì)優(yōu)質(zhì)中藥產(chǎn)品制造工藝提供了科學(xué)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 馬超一]endprint