孫 鶴 ，張 敏 ，魏 微 ，梁 鵬 ，2，陳麗嬌 ，2，程文健 ，2

大黃魚魚卵作為大黃魚加工過程中的主要副產(chǎn)物，其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA） 和磷脂 （Phospholipids，PLs），具有較高的食用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值[1]。PLs是構(gòu)成生物細(xì)胞的重要物質(zhì)，按其來源可分為動(dòng)物磷脂、植物磷脂、微生物磷脂。植物磷脂以大豆磷脂最為常見，但由于不飽和脂肪酸的存在，導(dǎo)致其穩(wěn)定性不高，易氧化變質(zhì)。生產(chǎn)PLs的微生物主要包括細(xì)菌、酵母等，但需借助高度的發(fā)酵技術(shù)，并進(jìn)行大量菌株的篩選，所以微生物來源的PLs要比動(dòng)植物性PLs昂貴得多。相比而言，由于海洋磷脂結(jié)合了大量的DHA、EPA，海洋磷脂的抗氧化性使得DHA-PLs和EPA-PLs在進(jìn)入人體后，可以較好地被人體細(xì)胞攝取。此外，相比于結(jié)合其他較低不飽和度的脂肪酸磷脂來說，DHA-PLs和EPA-PLs的氧化穩(wěn)定性更高。PLs種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同的PLs具有不同的生物學(xué)功能。研究表明，磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC） 具有提高免疫功能、改善肝臟脂質(zhì)代謝障礙、激活巨噬細(xì)胞活力、增強(qiáng)機(jī)體抵抗疾病的能力[2-3]。結(jié)合有DHA、EPA的PC，在擁有PC和EPA、DHA等各自功能特性的基礎(chǔ)上具有許多獨(dú)特的生物學(xué)活性。Martin Rossmeisl等人[4]研究發(fā)現(xiàn)富含ω-3多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFA） 的PLs能夠?qū)Ψ蔷凭灾靖纹鸬揭欢ǖ念A(yù)防作用；胡世偉等人[5]研究發(fā)現(xiàn)海參EPA-PC能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，改善口服葡萄糖耐量，促進(jìn)空腹血清胰島素的分泌，增加肝糖原含量。崔潔等人[6]研究表明DHA-PLs對試驗(yàn)性肥胖小鼠脂質(zhì)代謝具有良好的調(diào)節(jié)減肥作用。課題組前期采用大黃魚魚卵磷脂研究了其對小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明大黃魚魚卵磷脂具有顯著改善脂質(zhì)吸收的作用[7]。因此，近年來源于水產(chǎn)品中的PC作為PLs的主要功能組分越來越受到研究者的關(guān)注[8]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大黃魚魚卵中PC的含量高達(dá)60%以上，以氯仿-甲醇法提取的大黃魚魚卵粗磷脂為原料，分離純化出純度達(dá)96.34%的魚卵磷脂酰膽堿（Roe-PC）[9]。試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高大黃魚魚卵資源利用水平，在明確魚卵主要功能組分PC脂肪酸組成信息的基礎(chǔ)上，將Roe-PC制備成納米脂質(zhì)體，以期更好地提高其生物利用度。主要采用薄膜分散法[10]制備了Roe-PC納米脂質(zhì)體，通過噻唑蘭染色吸光值法（Methyl thiazolyl tetrazolium value，MTT） 初步探究了其對HepG2細(xì)胞的增殖效應(yīng)，為后續(xù)研究Roe-PC對HepG2細(xì)胞增殖效應(yīng)的分子機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大黃魚魚卵磷脂酰膽堿（Roe-PC），純度≥95%，自制；膽固醇，中國惠興生化試劑有限公司提供；氯仿，上海中試化工總公司提供；DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、二甲基椏楓（DMSO），美國Gibco公司提供；胰蛋白酶、MTT，美國Amiresco公司提供；人肝癌HepG2細(xì)胞，南京凱基生物科技有限公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FCD-270SE型海爾電冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司產(chǎn)品；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；680型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；DL-CJ-1N型超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器公司產(chǎn)品；Bj5060UV型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司產(chǎn)品；CKX41型倒置顯微鏡系統(tǒng)，Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Roe-PC脂肪酸組成的分析

委托上海市糧油制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，依據(jù)GB/T 17376—2008《動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯制備》和GB/T 17377—2008《動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯氣相色譜分析》進(jìn)行分析。

1.2.2 Roe-PC納米脂質(zhì)體的制備

將質(zhì)量比為1∶1.5的膽固醇和Roe-PC用少量的氯仿溶于容積為500 mL的圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度不宜過高，一般在30℃左右，得到一層干燥的PLs膜，加入一定量的D-Hanks振蕩混勻，然后在超聲儀上處理，直到其成為均勻的乳白色懸濁液。通過200 nm的微孔濾膜過濾后，即得到Roe-PC納米脂質(zhì)體。

1.2.3 Roe-PC納米脂質(zhì)體形態(tài)和大小的測定

采用透射電子顯微鏡觀察Roe-PC納米脂質(zhì)體的形態(tài)，將制得的Roe-PC脂質(zhì)體滴一滴到碳涂層銅網(wǎng)格，2 min后，用濾紙吸取水分，背景染色，采用1%的硅鎢酸鹽染色30 s，用濾紙除去多余的硅鎢酸鹽，采用透射電子顯微鏡觀察干樣品，并使用相機(jī)拍照[11]。

1.2.4 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%密度時(shí)傳代，一般3 d傳1次，每次1傳2，細(xì)胞生長穩(wěn)定、形態(tài)良好即可使用。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)。所有試驗(yàn)操作均在無菌條件下培養(yǎng)。

1.2.5 MTT法檢測Roe-PC納米脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基制成密度為2×105mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，100 L/孔。培養(yǎng)24 h后，對照組只加培養(yǎng)液，試驗(yàn)組加入Roe-PC納米脂質(zhì)體，使其質(zhì)量濃度分別為25，50，100，150，200，300，400 g/mL，每組質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)平行孔，置于37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24，48，72 h。每孔加20 L MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入二甲基椏楓（DMSO） 150 L/孔，振蕩器上振蕩溶解5～10 min，使其藍(lán)紫色結(jié)晶物完全溶解，用酶標(biāo)儀測490 nm處OD值，以T（樣品組OD值） /C（對照組OD值）表示細(xì)胞增殖活性。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以X±S表示，組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 大黃魚魚卵PC脂肪酸組成分析

大黃魚魚卵PC的脂肪酸組成分析結(jié)果見表1。

表1 大黃魚魚卵PC的脂肪酸組成分析結(jié)果/%，n=3

由表1可以看出，在大黃魚魚卵PC中檢測出13種脂肪酸，碳原子數(shù)為14～22，其中飽和脂肪酸（SFA） 5種，單不飽和脂肪酸（MUFA） 4種，多不飽和脂肪酸（PUFA） 4種。SFA主要包括豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸 （C16∶0）、十七烷酸 （C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、花生酸（C20∶0），以棕櫚酸（C16∶0）含量為最高，占總脂肪含量的24.8%。對于MUFA而言，在檢測到的MUFA中以油酸（C18∶1）含量最為豐富。脂肪酸是魚類生長發(fā)育階段重要的代謝能源，同時(shí)也是魚類機(jī)體重要的內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)。有研究表明C16∶0，C18∶1脂肪酸是魚類代謝的主要能量來源，試驗(yàn)結(jié)果與該結(jié)論一致，即C16∶0，C18∶1在大黃魚魚卵PC中含量較高。PUFA方面，PC中PUFA的含量高達(dá)44.9%，EPA、DHA占據(jù)了主要比例，其中DHA含量達(dá)到34.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他脂肪酸的含量。鄒舟等人[12]研究了鰱魚各部位磷脂的脂肪酸組成，結(jié)果表明各部位間EPA+DHA的總量，內(nèi)臟中明顯高于其他部位，其總和為27.12%。孫艷賓[13]研究了太平洋磷蝦油脂的提取工藝及其脂肪酸組成，其中EPA+DHA在油脂脂肪酸中含量為31.9%。宮勛等人[14]研究了池沼公魚肌肉的脂肪酸組成，其中EPA和DHA的含量分別為8.43%和11.85%，其總和為20.28%。由此可以看出大黃魚魚卵是富含EPA-PC和DHA-PC的海洋資源，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

2.2 Roe-PC納米脂質(zhì)體的形態(tài)和大小

Roe-PC脂質(zhì)體的透射電鏡形態(tài)見圖1。

圖1 Roe-PC脂質(zhì)體的透射電鏡形態(tài)

利用透射電子顯微鏡觀察Roe-PC納米脂質(zhì)體的形態(tài)。試驗(yàn)經(jīng)薄膜分散法制備得到的脂質(zhì)體為乳白色混懸液，在透射電鏡下觀察，放大1×105倍的Roe-PC納米脂質(zhì)體的電鏡顯示，脂質(zhì)體分布均勻、顆粒間彼此分散獨(dú)立、連續(xù)成圓形或橢圓形微球體，平均粒徑為100 nm。

2.3 Roe-PC脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

MTT比色法的檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀測定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量[15]。試驗(yàn)將前期純化所得的Roe-PC制作成納米脂質(zhì)體，并配制成不同濃度，檢測其在24，48，72 h下對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。表2是Roe-PC脂質(zhì)體處理HepG2細(xì)胞后進(jìn)行MTT測定得到的吸光值，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度5個(gè)重復(fù)。

Roe-PC脂質(zhì)體質(zhì)量濃度對HepG2細(xì)胞處理不同時(shí)間吸光值的影響（X±S） 見表2，Roe-PC脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響見圖2。

表2 Roe-PC脂質(zhì)體質(zhì)量濃度對HepG2細(xì)胞處理不同時(shí)間吸光值的影響（X±S）

以未添加Roe-PC脂質(zhì)體處理組為對照組，處理組與對照組比值的百分?jǐn)?shù)即為細(xì)胞增殖率，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的Roe-PC脂質(zhì)體處理HepG2細(xì)胞24 h后，其增殖活性沒有顯著變化，當(dāng)Roe-PC脂質(zhì)體質(zhì)量濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)其增殖活性才被顯著抑制（0.55±0.06 VS 0.74±0.04，p＜0.01），抑制率 （IR） 為 26%；而延長作用時(shí)間至48，72 h后，細(xì)胞增殖受到了抑制，受試物質(zhì)量濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，且隨著作用時(shí)間的延長，其抑制作用有增強(qiáng)的趨勢，Roe-PC質(zhì)量濃度為400μg/mL，作用時(shí)間為72 h時(shí)抑制作用最強(qiáng) （0.18±0.08 VS 0.89±0.07，p＜0.01），其 IR 達(dá)到80%。說明Roe-PC脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用具有時(shí)效和量效的關(guān)系。同時(shí)說明Roe-PC脂質(zhì)體有抑制癌細(xì)胞增殖的作用，但需要一定的作用時(shí)間后才能發(fā)揮效果。

圖2 Roe-PC脂質(zhì)體對Hep G2細(xì)胞增殖活性的影響

2.4 Roe-PC脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

Roe-PC脂質(zhì)體處理HepG2細(xì)胞72 h后的形態(tài)學(xué)變化見圖3。

圖3 Roe-PC脂質(zhì)體處理HepG2細(xì)胞72 h后的形態(tài)學(xué)變化

為了更直觀地觀察Roe-PC脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞的抑制作用，在顯微鏡下觀察未處理和400μg/mL Roe-PC脂質(zhì)體處理后的HepG2細(xì)胞，二者都培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡觀察并拍照。由圖3可知，正常對照組細(xì)胞呈匯合生長且貼壁性好，細(xì)胞輪廓清晰、密度大，相互排列緊密，連接成大片，細(xì)胞生長旺盛；Roe-PC脂質(zhì)體處理后的細(xì)胞數(shù)量顯著下降，并且收縮呈圓形，部分細(xì)胞脫落至培養(yǎng)液中，表明其生長與活力被顯著抑制。

3 討論

試驗(yàn)以大黃魚魚卵中獲得的PC為研究材料，首先分析了其脂肪酸組成信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PUFA的含量高達(dá)44.9%，而且EPA，DHA占據(jù)了主要組成比例，其中DHA含量更是高達(dá)34.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他脂肪酸的含量。進(jìn)一步采用薄膜分散法獲得了100 nm級的脂質(zhì)體，并對其形態(tài)進(jìn)行了表征。在此基礎(chǔ)上，初步開展了Roe-PC脂質(zhì)體對細(xì)胞增殖活性方面的研究，試驗(yàn)結(jié)果說明Roe-PC脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DHA對于腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用在許多細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物模型中得到了證實(shí)[16-19]。DHA能抑制直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。孫思楠[20]研究了不同濃度的DHA對人肝癌細(xì)胞株Bel-7402細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，DHA可抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，且呈時(shí)間-劑量依賴性。李群珍等人[21]以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，檢測了DHA聯(lián)合5氟尿嘧啶（5-FU）的體外抗腫瘤作用。結(jié)果表明，DHA聯(lián)合5-FU可抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，二者具有協(xié)同作用。Chapkin R S等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可通過改變生物膜的結(jié)構(gòu)和功能來抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。多不飽和脂肪酸是構(gòu)成生物膜結(jié)構(gòu)的脂肪酸，腫瘤細(xì)胞膜DHA比例升高導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞呼吸鏈?zhǔn)軗p，膜通透性增加，使細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子得以釋放，半胱氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)得以進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同樣，EPA對于腫瘤細(xì)胞的生長也具有一定的抑制作用。王占有[23]研究了不同濃度的EPA對人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明，一定濃度的EPA對HepG2細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，且隨作用時(shí)間的延長抑制率增加。其作用機(jī)制可能與其影響肝癌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化有關(guān)。盛虹[24]研究發(fā)現(xiàn)，EPA能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖并具有濃度依賴性，但無時(shí)間依賴性。

試驗(yàn)所獲得的PC主要與DHA協(xié)調(diào)發(fā)揮效果，但其具體機(jī)制尚不明確，有待今后更進(jìn)一步的研究。此外，Roe-PC脂質(zhì)體在體外的穩(wěn)定性如何還需要進(jìn)行深入的研究和分析。為今后開發(fā)Roe-PC脂質(zhì)體保健功能食品提供更為全面的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

大黃魚魚卵PC富含DHA和EPA，以魚卵中純化所得的PC為材料，采用薄膜分散法制備了Roe-PC納米脂質(zhì)體，以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行體外抗腫瘤試驗(yàn)，通過MTT法測定了Roe-PC納米脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明，Roe-PC納米脂質(zhì)體對HepG2細(xì)胞的生長抑制作用具有時(shí)效和量效的關(guān)系。研究結(jié)果對魚卵磷脂資源利用和進(jìn)一步深入研究其中的分子機(jī)制奠定了前期基礎(chǔ)。

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