趙 能, 陳中華， 原曉龍， 王 娟， 楊宇明， 王 毅*

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204；2.云南省林業(yè)科學(xué)院 國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204；3.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

牛樟芝(Antrodiacamphorata)又名樟芝、牛樟菇、樟生薄孔菌，是原產(chǎn)于臺(tái)灣的擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬的珍稀藥用真菌[1]。牛樟芝主要生長(zhǎng)在臺(tái)灣特有植物牛樟樹(shù)(Cinnamomumkanehirai)的樹(shù)干空洞內(nèi)[2]。在臺(tái)灣地區(qū)，牛樟芝一直作為一種藥物被廣泛用于治療高血壓、皮膚瘙癢等疾病，甚至還可用于改善肝功，增強(qiáng)脾胃免疫力[3]。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)，牛樟芝的提取物具有良好的抗癌、抗氧化、抗炎等活性[4]。經(jīng)過(guò)分離提取鑒定后，研究人員最終確定牛樟芝所具有的種種活性主要來(lái)源于其內(nèi)含有的倍半萜、三萜以及甾醇類(lèi)化合物[5]。之后，牛樟芝內(nèi)的萜類(lèi)化合物研究陸續(xù)得到報(bào)道[6-8]。早在1995年，研究人員就從牛樟芝中分離鑒定出了倍半萜內(nèi)酯[9]，但是之后對(duì)于牛樟芝內(nèi)的倍半萜化合物研究報(bào)道較少。直到2013年，Yeh等人發(fā)現(xiàn)從牛樟芝中分離出的一種名為antrocin的倍半萜物質(zhì)能夠使得肺癌細(xì)胞凋亡[10]，牛樟芝中的倍半萜化合物再次吸引研究人員。倍半萜類(lèi)化合物是指由3分子異戊二烯單位聚合而成，分子中含有15個(gè)碳原子的天然萜類(lèi)化合物群，其廣泛存在于植物界和微生物界[11]。在生物體內(nèi)，許多倍半萜類(lèi)化合物通常起防御與介導(dǎo)作用[12]，除此之外，倍半萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗神經(jīng)毒性、抗蟲(chóng)活性、昆蟲(chóng)拒食、抗病毒、保肝強(qiáng)心等生物活性[11]。所有萜類(lèi)化合物都是由五碳單元的異戊二烯二磷酸酯及其衍生物二甲基烯丙基二磷通過(guò)異戊烯轉(zhuǎn)移酶連接形成的，而倍半萜最終是由法尼基焦磷酸途徑(farnesyl diphosphate, FPP)中的倍半萜合酶所合成[13]。倍半萜合酶基因以基因家族的形式存在，家族中不同成員基因表達(dá)催化生成不同的倍半萜終產(chǎn)物[14]。在倍半萜生物合成研究上，最具代表性的是青蒿素的生物合成，青蒿素是由乙酰CoA經(jīng)甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)途徑合成FPP，經(jīng)紫穗槐-4,1l-二烯合酶(ADS)催化生成紫穗槐-4,1l-二烯，在紫穗槐-4,11-二烯P450羥基化酶(CYP7lAVl)催化下生成青蒿酸，再經(jīng)過(guò)其他催化反應(yīng)最后生成青蒿素。由于青蒿素的生物合成途徑得到較為全面的揭示，使用工程菌發(fā)酵獲得青蒿素的辦法已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)[15-16]。牛樟芝內(nèi)的倍半萜類(lèi)化合物雖然有良好活性，但是對(duì)牛樟芝倍半萜的生物合成未見(jiàn)報(bào)道，與青蒿素倍半萜的生物合成相同，如果研究得到牛樟芝某種倍半萜類(lèi)化合物的生物合成途徑，那么使用工程菌發(fā)酵同樣也能夠獲得相應(yīng)的倍半萜類(lèi)化合物。本文對(duì)牛樟芝已經(jīng)公布的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合已有文獻(xiàn)基礎(chǔ)，推測(cè)出與牛樟芝倍半萜合成相關(guān)的功能基因片段，并克隆獲得全長(zhǎng)cDNA，檢測(cè)不同培養(yǎng)基對(duì)牛樟芝倍半萜合成酶的表達(dá)狀況，最終為揭示牛樟芝倍半萜生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 牛樟芝菌絲體由昆明食用菌研究所提供，該牛樟芝菌絲體生長(zhǎng)于Malt extract培養(yǎng)基上。

1.1.2 不同碳氮源以及市售培養(yǎng)基的配制 根據(jù)之前研究結(jié)果[17]，篩選出15種適合于牛樟芝快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。配方見(jiàn)表1。

1.1.3 試劑及儀器 試驗(yàn)所用試劑為Ultrapure RNA Kit，TAKARA PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒，等。所用儀器為BIO RAD C1 000 PCR儀，霉菌培養(yǎng)箱(上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司)等。

表1 培養(yǎng)基配方及編號(hào)

續(xù)表1

1.2 方法

1.2.1 牛樟芝菌絲體培養(yǎng) 將牛樟芝菌絲體(1 mm)接種于配制好的不同配方培養(yǎng)基平板中央，24 ℃暗培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA提取 收獲在Glu培養(yǎng)基24 ℃暗培養(yǎng)2個(gè)月的牛樟芝菌絲，使用Ultrapure RNA Kit(康為世紀(jì))提取其總RNA。并用Nanodrop 2 000 (Thermo USA) 進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)后，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提總RNA的完整性。采用TAKARA PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒對(duì)所提總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第一鏈。

1.2.3 cDNA全長(zhǎng)克隆 依據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)牛樟芝倍半萜合酶基因特異引物AcTPS1F和AcTPS1R(表2)，以1.2.2反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)得到的特異引物擴(kuò)增AcTPS1基因。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s,72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，再將純化產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體中。最后測(cè)序驗(yàn)證插入的cDNA全長(zhǎng)。

表2 研究所用引物

1.2.4 牛樟芝倍半萜合酶AcTPS1基因表達(dá)的半定量測(cè)定 計(jì)以ACTPS1基因序列為模板的檢測(cè)引物TAcTPS1F和TAcTPS1R(表2)。將表1中的15種不同配方培養(yǎng)基培養(yǎng)兩個(gè)月后的牛樟芝菌絲體收獲立即放入液氮中，經(jīng)液氮研磨后，分別提取各培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛樟芝菌絲體總RNA并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。分別取15種培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛樟芝菌絲體RNA各1 μg，參照Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。然后各自取1μL cDNA用于半定量PCR檢測(cè)。半定量PCR反應(yīng)體系：引物TAcTPS1F和TAcTPS1R各1 μL，PCR master Mix：10 μL, cDNA：1 μL, distilled water：7 μL，并以β-tubulin為內(nèi)參，參照張文娟等[18]的方法，利用GENESNAPS圖像分析軟件測(cè)定凝膠成像系統(tǒng)中獲得的條帶的積分光密度，用積分光密度的相對(duì)定量繪制表達(dá)柱狀圖。

1.2.5 AcTPS1基因cDNA序列及其編碼蛋白氨基酸序列生物信息學(xué)分析 用NCBI的Blast在線工具以及本地軟件DNAMAN對(duì)AcTPS1以及4種真菌的倍半萜合酶基因進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)。MEGA軟件的鄰位相連算法(1 000次檢舉)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。亞細(xì)胞定位由TargetP完成，并用ExPASy 站點(diǎn)工具Protparam與在線軟件ProtScale分析蛋白理化特性以及親水性/疏水性，最后用Tmpred軟件分析AcTPS1蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長(zhǎng)cDNA克隆與序列分析

經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR后，克隆并獲得完整的牛樟芝cDNA序列，經(jīng)測(cè)序后可知全長(zhǎng)為969 bp，編碼323個(gè)氨基酸， GenBank登錄號(hào)為KY056179。將牛樟芝DNA進(jìn)行克隆，并測(cè)序，可知牛樟芝DNA序列全長(zhǎng)為1 153 bp。將克隆得到的牛樟芝菌絲體cDNA與DNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DNA中含有3個(gè)內(nèi)含子，在DNA序列上的位置從起始密碼子算起分別是50～111 bp，714～770 bp以及801～866 bp處。圖1為克隆得到的cDNA與DNA電泳圖。

圖1 牛樟芝菌絲體cDNA與DNA克隆Fig.1 Cloning of cDNA and DNA from Mycelia Antrodia camphorataM：Takara 1K DNA marker；1：克隆所得cDNA；2：克隆所得DNAM: Takara 1K DNA marker； 1: The cloned of cDNA； 2: The cloned of DNA

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲體內(nèi)AcTPS1基因表達(dá)量影響

將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA各取1 μL并用β-tubulin為內(nèi)參，用AcTPS1基因特異引物檢測(cè)倍半萜合酶基因在不同培養(yǎng)基中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2、3所示。

圖2 不同碳源牛樟芝倍半萜合酶基因表達(dá)Fig.2 Gene expression of Antrodia camphorata cultured in different carbon sources

由于4種市售培養(yǎng)基中沒(méi)有該基因表達(dá)，因此，4種市售培養(yǎng)基的表達(dá)沒(méi)有放在圖中。由圖2、3可以看出，使用不同碳源培養(yǎng)牛樟芝菌絲體時(shí)，只有葡萄糖作為碳源時(shí)該基因表達(dá)，而在剩余4種碳源中并沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。在使用不同氮源時(shí)，以番茄浸粉和酪蛋白胨為氮源時(shí)，該基因表達(dá)，剩余4種氮源中均沒(méi)有該基因表達(dá)。結(jié)合圖2與圖3來(lái)看，表達(dá)量最高的是以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基。

圖3 不同氮源倍半萜合酶基因表達(dá)Fig.3 Gene expression of Antrodia camphorata cultured in different nitrogen sources

2.3 牛樟芝倍半萜合酶AcTPS1氨基酸序列分析

AcTPS1基因氨基酸序列經(jīng)過(guò)在線軟件Protparam分析后可知該氨基酸序列由323個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸組成種類(lèi)為20種。其分子量為35 842.8 D，理論等電點(diǎn)5.29，摩爾消光系數(shù)1.308，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)38.35。利用亞細(xì)胞定位軟件推測(cè)AcTPS1位于細(xì)胞質(zhì)中。經(jīng)ProtScale分析后，推測(cè)該氨基酸序列有一定疏水性。將AcTPS1氨基酸序列用NCBI在線工具推測(cè)出其保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4所示，由圖4中的信息可以看出AcTPS1具有真菌萜類(lèi)合成酶的保守序列。再將AcTPS1氨基酸保守序列與其他4種真菌倍半萜合酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，還發(fā)現(xiàn)了AcTPS1具有倍半萜合成酶的保守結(jié)構(gòu)域RRx8W，在圖5中已用虛線框標(biāo)出。

圖4 AcTPS1保守序列推斷Fig.4 The Putative conserved domains of AcTPS1

圖5 AcTPS1與4種真菌倍半萜合酶序列比對(duì)Fig.5 Sesquiterpene synthase amino acid sequence alignmentFRTP：Fibroporia radiculosa(XP_012177824)；GSTP：Gelatoporia subvermispora(EMD36641)；LSTP：Laetiporus sulphureus(KZT00027)；DQTP：Daedalea quercina(KZT73360);*代表相同序列 FRTP：Fibroporia radiculosa(XP_012177824)；GSTP：Gelatoporia subvermispora(EMD36641)；LSTP：Laetiporus sulphureus(KZT00027)；DQTP：Daedalea quercina(KZT73360);*indicates the same sequence

2.4 牛樟芝倍半萜合酶AcTPS1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取真菌類(lèi)的倍半萜合酶基因、單萜合酶基因以及雙萜合酶基因與AcTPS1基因進(jìn)行序列比對(duì)并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)上可以看出，AcTPS1基因與8種真菌的倍半萜合酶聚為一類(lèi)，因此可以進(jìn)一步確定克隆出的AcTPS1基因正確。

圖6 AcTPS1與不同種真菌萜類(lèi)合酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 The phylogenetic tree of different fungi′s terpene synthase

3 討 論

本研究以牛樟芝基因組為基礎(chǔ)[19]，從中分析推斷出與其倍半萜合成相關(guān)的功能基因。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)，可以看到克隆得到的AcTPS1基因與不同種真菌的倍半萜合酶基因聚為一類(lèi)，由此初步推斷該基因?yàn)楸栋胼坪厦富?。由于真菌?lèi)的倍半萜功能基因研究較少，從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中難以得到與牛樟芝倍半萜合成基因親緣關(guān)系較近的真菌。采用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟菌絲體，研究該倍半萜合酶基因在不同培養(yǎng)基中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基對(duì)該基因的表達(dá)影響差別很大，當(dāng)?shù)匆恢绿荚床幌嗤瑫r(shí)，只有以葡萄糖作為碳源時(shí)該基因表達(dá)，其余4種均沒(méi)有表達(dá)，而碳源一致氮源不同時(shí)，只有兩種培養(yǎng)基使該基因表達(dá)。因此，想要大量獲得與該基因相關(guān)的倍半萜化合物，選擇以麥芽浸粉，酵母提取物為氮源，葡萄糖為碳源對(duì)牛樟芝菌絲體進(jìn)行大量液體培養(yǎng)會(huì)獲得較好效果。

不同培養(yǎng)基中倍半萜合酶基因表達(dá)量不同，恰恰解釋了培養(yǎng)真菌時(shí)的單菌多產(chǎn)物策略(OSMAC)為何在改變培養(yǎng)基時(shí)會(huì)得到不同化合物[20]，由于培養(yǎng)基成分不同，刺激了微生物的不同基因的表達(dá)，從而使得同種微生物在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生不同化合物[21]。同時(shí)，這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)也為牛樟芝發(fā)酵培養(yǎng)提供了一種新思路，在以往的發(fā)酵培養(yǎng)中，研究人員大多只注意到不同培養(yǎng)基對(duì)三萜總含量以及生物活性的影響[22-24]，然而利用生物信息學(xué)分析與分子生物學(xué)技術(shù)快速定位出功能基因并檢測(cè)其表達(dá)情況，能夠在較短時(shí)間內(nèi)從根本上找到最適宜某種化合物產(chǎn)生的培養(yǎng)條件，從而有目的地大量培養(yǎng)牛樟芝以得到目標(biāo)化合物。

以往，對(duì)萜類(lèi)化合物的研究主要是以植物為主[11]，在研究植物中的倍半萜類(lèi)物質(zhì)時(shí)，需要采集大量的植物材料進(jìn)行分離提取，但是微生物不同，可以通過(guò)液體發(fā)酵等培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，最后再分離得到倍半萜類(lèi)化合物進(jìn)行研究，相較于采集大量植物材料用于提取分離后者更為環(huán)保且快速[25]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，真菌中的萜類(lèi)化合物也逐漸得到重視。真菌能夠產(chǎn)生大量的活性物質(zhì)，萜類(lèi)化合物只是其中的一類(lèi)[26]，與植物相比，真菌能夠產(chǎn)生一些特殊的倍半萜類(lèi)化合物[27]，這就使得真菌倍半萜類(lèi)化合物更具研究?jī)r(jià)值。Yeh等人在2013年發(fā)現(xiàn)從牛樟芝中分離出的倍半萜類(lèi)化合物具有抗癌活性這一發(fā)現(xiàn)證明牛樟芝內(nèi)的倍半萜類(lèi)化合物具有極大開(kāi)發(fā)潛力[10]，雖然牛樟芝倍半萜類(lèi)化合物具有開(kāi)發(fā)潛力，但牛樟芝生長(zhǎng)極為緩慢，通過(guò)原始菌發(fā)酵獲得的提取物產(chǎn)量較低[28]，在培養(yǎng)技術(shù)上也有困難，比如生長(zhǎng)緩慢、化合物分離難度大、生產(chǎn)和修飾改造受到限制等等一系列問(wèn)題[29]。如果對(duì)牛樟芝內(nèi)倍半萜化合物生物合成途徑清楚，就能夠利用基因工程手段獲得倍半萜等活性化合物。并且由于微生物體內(nèi)天然產(chǎn)物的合成、調(diào)控和抗性基因通常是成簇排列的，只要在合適的宿主內(nèi)異源表達(dá)基因簇就能夠獲得大量天然產(chǎn)物及其衍生物[30]。因此，獲得潛在活性化合物生物合成基因是進(jìn)行基因工程手段獲得活性化合物的第一步。本研究成功地從牛樟芝克隆獲得一個(gè)誘導(dǎo)型倍半萜合酶基因，并確定其大量表達(dá)的條件，為發(fā)酵獲得牛樟芝倍半萜奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為未來(lái)利用基因工程手段獲得牛樟芝倍半萜奠定基礎(chǔ)。

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