劉 震， 董高超， 孫 林， 莫 朕， 夏亞穆

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042)

代謝工程是指利用基因重組技術(shù)有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，結(jié)合細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程，通過構(gòu)建新的代謝途徑來生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一門應(yīng)用性學(xué)科。二十世紀(jì)七十年代開始，隨著基因工程的迅猛發(fā)展，人們認(rèn)識到利用重組DNA技術(shù)可以改造微生物代謝途徑中特定的酶反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上1991年首次提出代謝工程的概念。經(jīng)過二十多年的發(fā)展，代謝工程逐漸發(fā)展成為一個新的學(xué)術(shù)領(lǐng)域，其利用重組DNA技術(shù)，有目的地操控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、調(diào)控以及酶的功能，改善細(xì)胞活性，廣泛應(yīng)用于微生物、植物和動物細(xì)胞中，一定程度上改變了人們的生活。外源基因?qū)胧腔蚬こ萄芯恐兄匾沫h(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)化方法主要包括載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和外源基因直接導(dǎo)入兩大類。在此期間，其他的一些無選擇標(biāo)記基因的方法如基因打靶和染色體工程應(yīng)運而生，這更大程度上源于對物種調(diào)節(jié)再生機制和轉(zhuǎn)化過程機理的了解。更進(jìn)一步，在染色體特定的區(qū)域無選擇性標(biāo)記基因和基因整合可以推進(jìn)代謝工程的實施。代謝途徑的基因修飾是代謝工程實施的重點，常見的策略包括引入目的靶基因、干涉靶基因的表達(dá)或?qū)刂粕锖铣傻霓D(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾。鋅酯核酸酶是近年來發(fā)展起來的定向改變基因組序列的技術(shù)，其在植物和微生物中的研究對于新藥研發(fā)和新品種選育等方面有著廣闊的前景。傳統(tǒng)沉默策略常常因序列同源性使整個基因序列不表達(dá)，鋅酯核酸酶和具有轉(zhuǎn)錄活性的效應(yīng)器核酸酶可以由足夠的特異性基因組來設(shè)計。

1 代謝工程在微生物中的應(yīng)用

早期，人們利用微生物發(fā)酵獲得發(fā)酵產(chǎn)品，對其開發(fā)利用主要集中在篩選高產(chǎn)菌株方面。隨著代謝工程的發(fā)展，微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)朝向目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)展。代謝工程基于對細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的研究，控制酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯，一方面人們可以調(diào)控微生物代謝通過篩選獲得高產(chǎn)菌株，另一方面也可以轉(zhuǎn)入目的基因生產(chǎn)特定的目標(biāo)產(chǎn)物。

1.1 在微生物藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用

很多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然化合物在自然界中含量比較低，很難大量獲得，設(shè)計微生物代謝生產(chǎn)一些藥物和前體藥物成為人們研究的重點。與其他高等生物相比，微生物細(xì)胞生長繁殖比較快速，并且微生物代謝途徑更容易修飾，因此人們可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行代謝調(diào)控來生產(chǎn)這些藥物。該方法最初用于聚酮和肽類化合物的合成中[1]，經(jīng)過十幾年發(fā)展，其在藥物的合成中得到了廣泛的應(yīng)用。Li等[2]在棒狀鏈霉菌中通過gap1和gap2的基因敲除并且在培養(yǎng)基中加入精氨酸，使鏈霉菌生產(chǎn)出抗生素克拉維酸。Asadollahi等[3]在釀酒酵母中異源表達(dá)植物倍半萜生物合成基因，下調(diào)ERG9基因并且在培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸，使釀酒酵母菌生產(chǎn)出抗癌藥瓦倫烯、抗病毒藥蓽澄茄醇和抗菌藥廣藿香醇。2013年，Alonso-Gutierrez等[4]在大腸埃希菌中設(shè)計甲羥戊酸途徑和檸檬烯合酶表達(dá)，使在大腸埃希菌中合成具有抑菌作用的檸檬烯和抗癌藥物紫蘇醇。2015年，Rodriguez等[5]通過敲除釀酒酵母菌兩種丙酮酸脫羧酶基因，并且引入大腸埃希菌莽草酸激酶，使釀酒酵母的香豆酸產(chǎn)量提高了7.9倍。

1.2 在發(fā)酵工業(yè)原料生產(chǎn)中的應(yīng)用

微生物發(fā)酵是工業(yè)原料的重要來源，代謝工程可以有目的地改造工業(yè)發(fā)酵菌種，使之高效地生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物。在丙酮丁醇梭菌中，丁醇的合成分為兩部分，Atsumi等[6]將其控制丁醇合成的基因組轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌中，提高了正丁醇的產(chǎn)量。2011年，Yu等[7]通過敲除酪丁酸梭菌的乙酸激酶突變體也提高了丁醇的產(chǎn)量。2013年，Curran等[8]將三步合成途徑基因?qū)脶劸平湍妇?，使得粘康酸第一次在釀酒酵母菌中合成。Runguphan等[9]在釀酒酵母中過表達(dá)參與脂肪酸合成的3個基因：乙酰-CoA羧化酶(ACC1)、脂肪酸合酶1(FAS1)和脂肪酸合酶2(FAS2)，增加了釀酒酵母中脂肪酸的產(chǎn)量。

2 代謝工程在植物中的應(yīng)用

植物在生長、代謝過程中會合成一些對植物體本身生命活動沒有明確功能的物質(zhì)，這些物質(zhì)稱為次級代謝產(chǎn)物，也是天然產(chǎn)物的重要來源。代謝工程可通過基因工程技術(shù)改變或構(gòu)建新的植物代謝途徑，以獲得有價值的次級代謝產(chǎn)物，其在植物中的應(yīng)用主要有兩方面，一是提高植物源天然產(chǎn)物產(chǎn)量，二是提高農(nóng)作物產(chǎn)量和營養(yǎng)價值。

2.1 增加植物源天然產(chǎn)物含量

幾個世紀(jì)以來，植物一直作為活性藥物的來源。近年來，統(tǒng)計表明75%的抗菌藥物和48.6%的抗癌藥物是天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物類似物[10]。其中許多天然藥物是通過物種特異性控制復(fù)雜的生物合成途徑獲得的[11]，例如莽草酸途徑、非甲羥戊酸途徑和甲羥戊酸途徑。這些途徑合成了包括萜類、生物堿、類黃酮和花青素等許多結(jié)構(gòu)多樣的化合物。一般情況下，人們通過分離提取來獲得這些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，由于植物體內(nèi)次級代謝產(chǎn)物含量很低，不能滿足人們正常需求。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，人們可以改造植物代謝途徑，通過轉(zhuǎn)入或刪除某些關(guān)鍵酶基因，促進(jìn)或抑制該基因表達(dá)，包括引入目的靶基因、干涉靶基因的表達(dá)或?qū)刂粕锖铣傻霓D(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾等，調(diào)控次級代謝產(chǎn)物及含量，解決天然源化合物獲取不足問題。Polturak等[12]對甜菜和紫茉莉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，確定了新的甜菜紅色素細(xì)胞相關(guān)P450型基因，將其導(dǎo)入煙草細(xì)胞中獲得了該色素的異源生產(chǎn)。Kai等[13]通過編碼引入3-羥基-3-甲基輔酶A還原酶、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸核酶和香葉基焦磷酸合成酶到丹參植物中，獲得了高產(chǎn)量的二萜類化合物丹參酮，此類化合物廣泛用于治療心血管疾病。紫杉醇是有效的抗癌化合物，目前用于治療卵巢癌、乳腺癌和肺癌，以及艾滋病卡波濟(jì)氏肉瘤。紫杉醇在紅豆杉樹皮中含量極低，如今研究方向轉(zhuǎn)為通過代謝工程提高紫杉醇產(chǎn)量，從而降低生產(chǎn)成本。通過前體喂養(yǎng)、雜交探針和差異基因表達(dá)研究證實了紫杉醇合成路徑中19步假定的步驟[14-15]如圖1所示。紫杉烯合成酶(TASY)是紫杉醇的生物合成最關(guān)鍵的一種酶，如果在毛狀根培養(yǎng)時上調(diào)該基因的表達(dá)可以增加得到265%的紫杉醇產(chǎn)量[16]。Groteau等[17]通過正向調(diào)控參與脫落酸生物合成的關(guān)鍵基因-9-順-環(huán)氧類雙加氧酶基因，使紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的脫落酸積累量增加了48%和紫杉醇積累量達(dá)到2.7倍。

2.2 增加農(nóng)作物產(chǎn)量和營養(yǎng)價值

2014年，糧農(nóng)組織發(fā)布的《糧食不安全狀況2014》指出，全世界饑餓人口高達(dá)10.2億，創(chuàng)歷史最高水平。利用代謝工程調(diào)控植物代謝可以增加農(nóng)作物產(chǎn)量和營養(yǎng)價值，緩解糧食危機。2013年，Pons等[18]通過RNA干擾阻斷內(nèi)源性β胡蘿卜素羥化酶基因(Csβ-CHX)增強了橙子中β-胡蘿卜素的含量，同時通過過表達(dá)植物開花控制基因(CsFT)，縮短了果實成熟周期。在水稻胚乳中水仙花八氫番茄紅素合成酶的表達(dá)使得無色胡蘿卜素八氫番茄紅素得以積累，獲得“金谷”[19]。β-胡蘿卜素羥化酶和β-胡蘿卜素酮化酶是藻類中參與蝦青素合成的兩種關(guān)鍵酶，Huang等[20]將這兩種酶在番茄中過表達(dá)增加了番茄中蝦青素的含量，提高了番茄的營養(yǎng)價值。

圖1 紫杉醇的生物合成途徑Fig.1 Paclitaxel biosynthetic pathway

3 代謝工程在動物細(xì)胞的應(yīng)用

動物細(xì)胞的生長代謝和生理模式比較復(fù)雜，另一方面體外細(xì)胞培養(yǎng)受外界影響因素比較大，代謝工程在動物細(xì)胞中發(fā)展起步要晚。

3.1 在生物制品生產(chǎn)中的應(yīng)用

動物細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)勢在于其復(fù)雜的蛋白質(zhì)表達(dá)能力，因此可以利用代謝工程優(yōu)化代謝途徑增加疫苗、抗體和生長因子等生物制品的生產(chǎn)，或者構(gòu)建新的代謝途徑生產(chǎn)特定的生物藥物。楊振西等[21]通過構(gòu)建乙肝病毒S-抗原和preS1抗原表位融合蛋白載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，篩選獲得了高表達(dá)S蛋白的CHO細(xì)胞系。體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞代謝往往由于產(chǎn)物積累使葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的轉(zhuǎn)化率升高，這會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，代謝副產(chǎn)物積累直至細(xì)胞死亡。重新改造細(xì)胞代謝途徑方向，如在BHK-21細(xì)胞中導(dǎo)入丙酮羧酸化酶基因，不僅對細(xì)胞生長沒有抑制作用而且能有效減少葡萄糖的消耗、降低乳酸產(chǎn)率[22]。

3.2 在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

細(xì)胞程序化死亡是細(xì)胞受基因控制自主化凋亡的過程，代謝工程在動物細(xì)胞中的應(yīng)用還體現(xiàn)在改變細(xì)胞凋亡程序、控制細(xì)胞循環(huán)周期。研究證明,在雜交瘤細(xì)胞中添加bcl-2等抑制細(xì)胞死亡的基因能顯著提高細(xì)胞活力，延長生長期，導(dǎo)入IRF-1(干擾調(diào)節(jié)因子)的BHK細(xì)胞生長被阻滯[23]。另有一些基因如bax、bcl-xS、bad和bak能激活細(xì)胞內(nèi)部線粒體凋亡程序從而促使細(xì)胞死亡[24]。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶類，是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，在凋亡因子的作用下使細(xì)胞內(nèi)部蛋白質(zhì)降解發(fā)生凋亡[25]?？刂萍?xì)胞無限制生長和使癌變細(xì)胞凋亡可以在根本上治療癌癥和腫瘤，這些研究在癌癥等疾病的基因治療中給人們提供了思路。

4 問題與展望

代謝工程發(fā)展已有二十多年，大量物種的全基因組測定和功能基因組學(xué)技術(shù)出現(xiàn)，對物種的認(rèn)識不僅限于代謝水平，而且能夠從基因、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物等多層次分析物種，即后基因組時代的“系統(tǒng)代謝工程”。代謝工程通過重組DNA技術(shù)改造細(xì)胞特性，當(dāng)前主要問題是如何正確詮釋酶的功能特性來優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑。盡管“組學(xué)”時代已經(jīng)增加了許多可用的數(shù)據(jù)，但正確的詮釋和酶的功能特性是代謝工程策略成功實施的關(guān)鍵。此外，生物合成途徑之間復(fù)雜的相互作用和復(fù)雜的調(diào)控機制使得代謝工程進(jìn)一步復(fù)雜。因此，更復(fù)雜的工程策略，其調(diào)節(jié)表達(dá)的多個通路基因或者調(diào)節(jié)器對于平衡產(chǎn)品是必須的。定義這些策略需要詳細(xì)的系統(tǒng)知識和復(fù)雜的代謝模型，目前來說缺乏這些系統(tǒng)及代謝模型。當(dāng)前穩(wěn)定轉(zhuǎn)換系統(tǒng)是耗費時間的，所以獲得高轉(zhuǎn)化產(chǎn)率顯得格外重要。最后，對于實施這些代謝工程系統(tǒng)，適當(dāng)?shù)墓芾矸ㄒ?guī)是很重要的，這可以使人們接受這些代謝工程產(chǎn)品。

代謝工程作為一種針對性比較強的生物代謝改造技術(shù)，其應(yīng)用必將越來越廣泛。隨著資源匱乏、糧食危機和對藥物需求量的增大，代謝工程在今后改善這些問題中將發(fā)揮重要作用。

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