時方方 閆 偉 高鳳騰 王桂玲
(泰山醫(yī)學院藥學院,山東 泰安 271000)
半枝蓮為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D Don的干燥全草,味辛微苦,全草入藥。具有清熱解毒、化瘀利尿的功效,可用于疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌打傷痛、蛇蟲咬傷等,臨床研究證明還具有抗腫瘤作用。主要含有黃酮類、多糖類、二萜類等成分[1-4]。白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa willd[Oldenlandia d if f usa (Willd.) Rox b.]的干燥全草,性甘、寒、微苦,以全草入藥,主要功效是清熱、解毒、利濕。用于癰腫瘡癤、肺熱咳喘、毒蛇咬傷等,主要含有蒽醌類、黃酮類、生物堿類等成分[5-8]。半枝蓮和白花蛇舌草同屬清熱解毒類中藥,二者常以藥對形式出現(xiàn)在各種臨床應用中。黃酮類化合物作為兩者主要的成分,近年來的研究證實具有抗菌消炎、清熱解毒、抗氧化等療效[9-10]。
本研究是以兩者共有的黃酮類化合物作為研究對象,以總黃酮的提取率為考察指標,采用Box-Behnken效應面法優(yōu)選半枝蓮和白花蛇舌草藥對中總黃酮的提取工藝,本研究為半枝蓮和白花蛇舌草藥對中黃酮類成分的進一步開發(fā)和應用提供了參考和依據(jù)。
1.1儀器
SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(上??婆d儀器有限公司);KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-5200紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);MP-300D電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司);HH-2數(shù)星恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器廠)。
1.2材料和試劑
半枝蓮(山東晟銀多寶中藥飲片科技有限公司);白花蛇舌草(亳州市中正中藥材飲片有限公司);蘆丁標準品(批號16031813,純度98%,中國百歐博偉生物技術(shù)有限公司);三氯化鋁(上海廣諾化學科技有限公司);水為純凈水,其它試劑均為分析純。
2.1含量測定
2.1.1對照品溶液的制備
精密稱量蘆丁對照品2 mg,甲醇溶解定容至10 ml量瓶中,配成濃度為0.2 mg·ml-1的溶液,備用。
2.1.2三氯化鋁溶液的制備
稱取適量三氯化鋁蒸餾水溶解定容至500 ml量瓶中,制成5%的三氯化鋁溶液,備用。
2.1.3測定波長的選擇
量取“2.1.1”項蘆丁對照品溶液1 ml,置于25 ml量瓶中,加入3 ml三氯化鋁溶液,甲醇定容,搖勻,靜置10 min,以不加對照品的溶液做為空白,在紫外分光光度儀上200~600 nm波長范圍內(nèi)掃描,結(jié)果顯示對照品溶液在414 nm出現(xiàn)最大吸收,因此確定最大吸收波長為414 nm。
2.1.4標準曲線的繪制
精密移取“2.1.1”項蘆丁對照品溶液0 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml分別置25 ml量瓶中,各加入3 ml三氯化鋁溶液,甲醇定容,搖勻,靜置10 min,以不加對照品的溶液作空白,在414 nm處測定吸光度。以溶液的濃度C為橫坐標, 吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線。得回歸方程A=29.313C+0.005 R2=0.9996,表明蘆丁在0.0064~0.0128 mg·ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系。
2.2單因素實驗
2.2.1不同配比的考察
將半枝蓮和白花蛇舌草以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3不同比例分別稱取3 g,分別置于已編號的圓底燒瓶中,各加入20倍量體積分數(shù)為70%的乙醇,回流提取1.5 h。抽濾,濾液加水定容至100 ml量瓶中,混勻,移取適量溶液于坩堝中,蒸干,少量甲醇超聲溶解,轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中,再加3ml的三氯化鋁溶液,甲醇定容至刻度,靜置10 min,在414 nm處測定吸光度。按“2.1.4”項標準曲線計算含量。結(jié)果如圖1所示。
圖1 不同配比對提取率的影響
從圖1可以看出,半枝蓮和白花蛇舌草配比不斷發(fā)生變化時,提取率呈明顯的下降趨勢,當配比為3∶1和2∶1時,提取率都很高。但考慮到兩者在藥對中比例的均衡,故選擇半枝蓮和白花蛇舌草配比為2∶1。
2.2.2乙醇體積分數(shù)的考察
在確定配比(2∶1)的條件下稱取半枝蓮和白花蛇舌草7份,每份3 g,分別置于已編號的圓底燒瓶中,各加入20倍量體積分數(shù)為35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇,回流提取1.5 h。余下操作同“2.2.1”項。結(jié)果如圖2所示。
圖2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響
從圖2可以看出,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,黃酮的提取率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢,在體積分數(shù)為75%時達到最大,所以選擇體積分數(shù)為75%的乙醇作為提取溶劑。
2.2.3料液比的考察
按配比(2∶1)稱取半枝蓮和白花蛇舌草6份,每份3 g,分別采用15、20、25、30、35、40倍量的75%乙醇,回流提取1.5 h。余下操作同“2.2.1”項。結(jié)果如圖3所示。
從圖3可以看出,隨著料液比倍數(shù)的增加,黃酮提取率也隨之增加,但當料液比為25倍量后,增加幅度不明顯,故選擇料液比25倍量的為宜。
2.2.4提取時間考察
按配比(2:1)稱取半枝蓮和白花蛇舌草6份,每份3 g,采用25倍量的75%乙醇,分別提取0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,余下操作同“2.2.1”項。結(jié)果如圖4所示。
從圖4可以看出,隨著提取時間的延長,黃酮提取率呈增加的趨勢,但當提取時間達到2 h后,增加幅度不明顯,故選擇提取時間為2h。
2.3Box-Behnken效應面法優(yōu)化總黃酮的提取工藝
2.3.1設計方案與實驗結(jié)果
采用軟件Design-Expert8.05b中Box-Behnken實驗設計模塊,綜合單因素考察的結(jié)果,選取配比(A)、乙醇體積分數(shù)(B)、料液比(C)、提取時間(D)四個較為顯著的因素為自變量進行優(yōu)化,每個因素設3個水平,分別用-1、0、1表示,以總黃酮的提取率(Y,mg·g-1)作為評價指標,具體的實驗設計方案及結(jié)果如表1、2所示。
表1 實驗設計自變量、水平表
表2 實驗設計結(jié)果
表3 方差分析結(jié)果
2.3.2數(shù)據(jù)處理及模型擬合
利用Design-Expert8.05b軟件對上述表格中的數(shù)據(jù)分析,以總黃酮提取率為因變量,對作為自變量的因素(A、B、C、D)進行二項式擬合,得到回歸方程Y=24.07+3052A-0.80B+0.92C+1.86D-0.50AB+0.69AC+0.49AD-1.06BC+0.12BD-1.07CD+0.72A2+0.31B2-0.17C2+1.50D2,R2=0.9878,由方程的相關系數(shù)可以看出,因變量和自變量擬合的二項式方程相關系數(shù)較高,擬合效果好。其方差(如表3所示)分析表明該模型具有顯著性(P<0.001),失擬效果不顯著,各個因素的一次方對模型有顯著的影響。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明該擬合的方程的模擬效果較好,可以用于不同條件下的結(jié)果預測。
圖3 料液比對提取率的影響
圖4 提取時間對提取率的影響
2.3.3提取工藝的響應面法分析及其優(yōu)化
采用Design-Expert8.05b軟件,根據(jù)擬合的二項式方程,繪制總黃酮提取率隨因素變化的等高線圖,以確定最佳的提取工藝條件。結(jié)果如圖5~8所示。從各因素的等高線圖5~8可以看出,配比、乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間對總黃酮提取率的影響基本呈一次關系,其中配比隨著半枝蓮所占比例的增加,總黃酮提取率呈現(xiàn)出增加的趨勢;乙醇體積分數(shù)隨著體積分數(shù)的增加,呈現(xiàn)出下降的趨勢;料液比隨著倍數(shù)的增加也呈現(xiàn)出增加的趨勢;提取時間隨著時間的延長也呈現(xiàn)出增加的趨勢。
圖5 配比對總黃酮提取率影響的等高線
圖6 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率影響的等高線
圖7 料液比對總黃酮提取率影響的等高線
圖8 提取時間對總黃酮提取率影響的等高線
結(jié)合軟件中模型及相應的等高線圖和曲面圖的分析結(jié)果:半枝蓮和白花蛇舌草總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為配比2.85∶1、乙醇體積分數(shù)為65.15%、料液比為1∶28.09,提取時間為2.49 h,提取率為33.5839 mg·g-1。
2.3.4驗證實驗
在此最佳工藝條件下進行驗證實驗(31.6467 mg·g-1、29.6025 mg·g-1、29.5457 mg·g-1,RSD=0. 51%,n=3)。平均提取率為30.2650 mg·g-1,與模型預測的結(jié)果接近,可以得到較高的總黃酮提取率,說明該模型可靠。
2.3.5提取次數(shù)的考察
稱取半枝蓮和白花蛇舌草共3 g,按照最佳工藝條件,配比2.85∶1,乙醇體積分數(shù)為65.15%,料液比為1∶28.09,回流提取2.49 h,提取率為33.5839 mg·g-1過濾,濾渣再加入相同體積的乙醇再提取一次,過濾,濾渣再加入相同體積的乙醇提取一次,共提取3次,每次濾液統(tǒng)一加蒸餾水定容到100 ml量瓶中,混勻,用移液管移取適量于坩堝中,蒸干,余下操作同“3.2.1”項。結(jié)果如圖9所示。
圖9 提取次數(shù)對提取率的影響
從圖9可以看出,隨著提取次數(shù)的增加,黃酮提取率呈明顯下降的趨勢,為了使提取完全以提取2次為宜。
2.3.6確定的提取工藝條件
綜合以上分析,確定最佳的提取工藝條件為半枝蓮和白花蛇舌草配比為2.85∶1,乙醇體積分數(shù)為65.15%,料液比為1∶28.09,回流提取2次,提取時間為2.49 h。在此條件下進行3次驗證實驗,3次測得的提取率接近。
效應面法比正交實驗法更簡化比均勻設計更全面,試驗精度高,并適用于多因素、多水平的試驗。該設計法最大的優(yōu)點是可對未做過的實驗進行預測,但同時需要有豐富的專業(yè)知識和一定的預實驗確定各因素的范圍,現(xiàn)已廣泛應用于藥學研究領域。
Box-Behnken效應面法確定最佳的提取工藝條件為半枝蓮和白花蛇舌草配比為2.85∶1,乙醇體積分數(shù)為65.15%,料液比為1∶28.09,回流提取2次,提取時間為2.49 h。Box-Behnken效應面法優(yōu)選的提取工藝簡便可行,預測效果好,可以得到較高含量的黃酮,有一定的應用前景。
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