俞璐，曹曉華，趙政，賀文迪，夏明

急性缺血性腦卒中以其高發(fā)病率，高致殘率和高致死率的疾病特點(diǎn)[1]，嚴(yán)重危害人類生命健康。動(dòng)物腦缺血模型可以模擬人類相應(yīng)的腦缺血疾病，在眾多局灶性腦缺血模型制備方法中，以Zea Longa于上世紀(jì)發(fā)明的大腦中動(dòng)脈線栓法[2]（middle cerebral artery occlusion，MCAO）應(yīng)用最為廣泛，其特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)在于：無(wú)需開(kāi)顱，創(chuàng)傷較小；缺血部位相對(duì)固定，可控性好；可實(shí)現(xiàn)腦缺血后再灌注，是理想的標(biāo)準(zhǔn)局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蚚3]。但在模型制備過(guò)程中，易受眾多因素影響，模型成功率、梗死體積大小、蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率不盡相同，且該手術(shù)對(duì)人員操作技術(shù)要求較高，不同實(shí)驗(yàn)室、不同實(shí)驗(yàn)員制備的模型差異較大。筆者將通過(guò)自身操作經(jīng)驗(yàn)結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)線栓法制備MCAO模型談幾點(diǎn)個(gè)人體會(huì)。

1 動(dòng)物選擇

1.1 動(dòng)物品系

目前MCAO動(dòng)物模型多選用嚙齒類小動(dòng)物，其具有購(gòu)買及飼養(yǎng)費(fèi)較低，大、小鼠均具有神經(jīng)功能損傷的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，較易得到不同特性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)[4]。大鼠基因具有與人類基因98%的同源性，遺傳差異小，品種一致性好，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，腦血管解剖結(jié)構(gòu)與人類相似度高，其生理機(jī)能變異小，且具有較強(qiáng)的抗感染能力和生命力，是腦缺血研究中應(yīng)用最為廣泛的動(dòng)物模型。Fischer-334、SD、Nistar等品系大鼠均可用于MCAO的動(dòng)物模型，但不同品種大鼠在阻斷大腦中動(dòng)脈后體積大小和穩(wěn)定性不同。國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)，Nistar大鼠MCAO平均腦梗死體積最小，梗死灶變異大；Fischer-334大鼠梗死體積最大，大腦中動(dòng)脈變異小，動(dòng)脈阻塞后形成的梗死體積一致性好，而SD大鼠居于兩者之間[5]。但因鼠源問(wèn)題，目前多選用性情溫和、生長(zhǎng)快、價(jià)格便宜的SD大鼠。SD大鼠在MCAO手術(shù)后，梗死體積較Nistar大鼠大，恒定性好，缺血半暗帶所占體積明顯小于Nistar大鼠。同時(shí)，考慮到大鼠雌激素水平對(duì)腦缺血損傷可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[6，7]及激素水平的生理性波動(dòng)對(duì)大鼠情緒的影響，筆者采用血管解剖結(jié)構(gòu)更為清晰的雄性SD大鼠作為MCAO的動(dòng)物模型。

1.2 體重和鼠齡

研究表明，大鼠大腦中動(dòng)脈的長(zhǎng)度和粗細(xì)與其體重形成正比[8]。目前多主張大鼠體重控制在250～300 g。筆者在實(shí)驗(yàn)中采用260～280 g大鼠，理由如下：鼠齡小，體重輕，對(duì)造模手術(shù)耐受性差；體重較輕的大鼠血管更細(xì)，手術(shù)時(shí)線栓不易插入，增加手術(shù)創(chuàng)傷；體重＞300 g的大鼠，血管增粗，線栓不能充分阻斷血流，梗死效果不佳，而且術(shù)后能快速建立側(cè)枝通路循環(huán)，不利于評(píng)估藥物療效。

2 術(shù)前準(zhǔn)備

2.1 術(shù)前飲食

對(duì)于術(shù)前飲食，國(guó)內(nèi)主流的觀點(diǎn)是禁食不禁水，一般禁食時(shí)間為12 h[9]，其目的是防治麻醉狀態(tài)下食物的返流和誤吸。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠在禁食過(guò)程中體重可下降10～12 g，禁食后的大鼠在造模完成后3 d內(nèi)精神狀態(tài)差，食物攝入量少，容易因營(yíng)養(yǎng)不良出現(xiàn)衰竭死亡。更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，葡萄糖/能量代謝障礙是引起缺血性腦損傷的主要原因[10]。因此，筆者主張?jiān)谛g(shù)前自由飲食以提高大鼠對(duì)手術(shù)耐受力，降低術(shù)后死亡率；手術(shù)時(shí)，將大鼠頭部偏向一側(cè)能防止食物返流和誤吸引起的窒息。

2.2 麻醉

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中較常用的麻醉劑包括乙醚、異氟烷、戊巴比妥鈉和水合氯醛等。乙醚和異氟烷屬于吸入性麻醉劑，作用時(shí)間較短，需要持續(xù)性給藥，給藥劑量不易控制，對(duì)呼吸道刺激較大，影響肌張力，需要借助氣體麻醉設(shè)備，且異氟烷對(duì)腦缺血再灌注損害具有保護(hù)作用[11]，故腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ鸵话悴挥璨捎谩Ｎ彀捅韧租c和水合氯醛均可通過(guò)腹腔注射，操作簡(jiǎn)單，是實(shí)驗(yàn)操作中使用最多的麻醉劑。研究證實(shí)，戊巴比妥鈉在麻醉潛伏期有較劇烈的四肢強(qiáng)直、痙攣等表現(xiàn)，需要進(jìn)入深度麻醉期后上述癥狀才能消失，而水合氯醛的麻醉潛伏期短于戊巴比妥鈉，起效較迅速，同時(shí)對(duì)大鼠體溫和呼吸運(yùn)動(dòng)的抑制作用小于戊巴比妥鈉，但兩藥均有抑制心肌收縮的作用[12]。因水合氯醛價(jià)格低廉，起效較快，對(duì)大鼠呼吸、心率影響較小，故筆者在實(shí)驗(yàn)中采用10%水合氯醛（0.40 mL/100g）腹腔注射麻醉。但在麻醉過(guò)程中需要注意以下幾點(diǎn)：按照比例現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存；抓取大鼠時(shí)避免過(guò)度掙扎，應(yīng)輕柔有效；在左側(cè)腹直肌旁側(cè)0.5 cm進(jìn)針，通常呈30～40°進(jìn)針，深度為1.5～2.0 cm，避免右腹進(jìn)針，以防刺中肝臟；當(dāng)出現(xiàn)因麻醉劑過(guò)量致口鼻分泌物增多現(xiàn)象，可用鑷子將舌頭拉出置于偏側(cè)防止誤吸；嚴(yán)格按照動(dòng)物體重計(jì)算麻藥劑量，若首次劑量未完全麻醉，可根據(jù)麻醉程度逐步加量，一般加0.1～0.2 mL，1～2次，直至大鼠全身松軟，不能自主活動(dòng)，生命體征平穩(wěn)，逐量給藥亦能減少其對(duì)心功能的抑制作用，但麻藥過(guò)量可致大鼠死亡；水合氯醛在臨床上亦可用于治療高熱驚厥[13]，故使用該藥麻醉特別需要注意術(shù)中及術(shù)后保暖，待大鼠蘇醒后撤除保暖設(shè)備可降低死亡率。

3 線栓制備和插線深度

3.1 線栓的制備

線栓是制備MCAO模型的關(guān)鍵材料，Longa和koizumi作為最早采用線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈的研究者，兩者在線栓頭的處理上各有不同，Longa把小段尼龍線的一端在酒精燈火焰上燒灼使其融化成一個(gè)膨大的球狀[2]，而Koizumi在尼龍線上均勻涂上硅樹(shù)脂[14]，但由于技術(shù)要求高，線栓頭處理標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，易造成模型制作失敗。線栓的材質(zhì)、粗細(xì)、線頭的形狀和包被均影響到模型制備效果。為保證線栓規(guī)格的一致性，減少線栓對(duì)模型制備的影響，筆者在實(shí)驗(yàn)中采用北京西濃科技有限公司制作的成品線栓，線栓采用柔韌適度的單絲尼龍線（線直徑0.26 mm，線長(zhǎng)40 mm），經(jīng)顯微操作燒制而成，頭端燒熔為半球形，頭部直徑（0.36±0.02）mm，前端20 mm包被多聚-L-賴氨酸，不改變線栓直徑，距頭端19～20 mm處黑色標(biāo)記，頭部形狀圓潤(rùn)的線栓易于進(jìn)入顱內(nèi)而不刺破血管，同時(shí)也易于掌握插入深度，從而形成較穩(wěn)定的腦梗死面積，大鼠死亡率較低。

3.2 線栓插入

體重250～300 g的大鼠目前較多采用線栓插入深度為從頸總動(dòng)脈分叉部起18～20 mm[15]。筆者的操作經(jīng)驗(yàn)，線栓插入深度為從頸總動(dòng)脈分叉處插入約20 mm，即將線栓送入頸內(nèi)動(dòng)脈后，黑色標(biāo)記點(diǎn)過(guò)分叉點(diǎn)約1 mm，感覺(jué)稍有阻力時(shí)即停止插入。同時(shí)線栓插入血管時(shí)，應(yīng)注意以下幾方面：由于目前采用盲插法居多，當(dāng)線栓由頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈后，極易誤插入頸內(nèi)動(dòng)脈的分支翼腭動(dòng)脈造成模型失敗。筆者的操作經(jīng)驗(yàn)是，當(dāng)線栓進(jìn)入頸總動(dòng)脈分叉點(diǎn)后，應(yīng)適當(dāng)將其壓低，保持線栓與水平線夾角15°左右，可有效降低插入翼腭動(dòng)脈幾率；頸總動(dòng)脈分叉點(diǎn)的位置并不恒定，不應(yīng)將分叉點(diǎn)的位置作為插入線栓深度的測(cè)量標(biāo)志；當(dāng)線栓插入阻力過(guò)大時(shí)，或由于血管扭曲所致，此時(shí)切不可猛插強(qiáng)插，可將線栓緩慢退出，讓血管回復(fù)到解剖結(jié)構(gòu)，待恢復(fù)血流后可再次嘗試線栓插入；線栓插入過(guò)程中盡量不要多次的來(lái)回抽插，避免血管內(nèi)膜損傷。

4 模型制備

4.1 手術(shù)器械

由于大鼠的血管和神經(jīng)十分纖細(xì)，MCAO模型制備需要精密度較高的手術(shù)器械來(lái)完成。筆者在分離血管時(shí)選用顯微鑷，各型號(hào)頭寬0.1～0.3 mm，能夠有效分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈；為避免顯微鑷多次分離組織后頭端毛糙，在分離肌肉組織時(shí)采用普通眼用鑷。同時(shí)采用1 mL注射器的針頭刺破頸總動(dòng)脈留下大小合適的針孔便于線栓插入，注射器針頭鋒利且尖銳，刺破血管同時(shí)又避免割斷血管。手術(shù)器械的選用在MCAO手術(shù)中尤為重要，恰當(dāng)?shù)钠餍悼墒共僮鬟^(guò)程中血管損害降到最低，減少出血量和手術(shù)時(shí)間，提高造模成功率。

4.2 手術(shù)切口

手術(shù)一般以頸側(cè)部作為切口，為避免傷及左側(cè)迷走神經(jīng)造成對(duì)心臟的影響[16]，手術(shù)時(shí)以右頸側(cè)為切口，長(zhǎng)約2.0～2.5 cm，切口往下依次為：頜下腺、下頜淋巴結(jié)、胸鎖乳突肌、胸骨舌骨肌等，右頸側(cè)較易于進(jìn)行肌肉和血管分離，視野暴露較好；如尋找血管困難，可適當(dāng)擴(kuò)展切口至3.0 cm，但操作時(shí)避免反復(fù)撥弄神經(jīng)或探入切口過(guò)深損傷氣管。

4.3 線栓插入位置與走向

線栓插入位置有自頸外動(dòng)脈插入和自頸總動(dòng)脈插入2種。但頸外動(dòng)脈較細(xì)，插入過(guò)程中容易扯斷或誤剪斷血管，操作難度大，故而筆者采用頸總動(dòng)脈插入線栓法，其插入手法簡(jiǎn)單易行，且血管不易扯斷，對(duì)氣管刺激性小，血管損害僅在頸總動(dòng)脈局部[17]。操作時(shí)，為避免術(shù)中出血及線栓插入頸外動(dòng)脈，筆者先將頸外動(dòng)脈結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈各放置一根活線，以備線栓插入后固定線栓用。線栓走向即進(jìn)入頸總動(dòng)脈后，由頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，進(jìn)入大腦前動(dòng)脈后回抽1～2 mm即插入大腦中動(dòng)脈，此時(shí)，線栓黑色標(biāo)記點(diǎn)滑入頸總動(dòng)脈分叉點(diǎn)1 mm，腦缺血計(jì)時(shí)開(kāi)始。值得注意的是，如果線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約10 mm就感到阻力明顯，則提示線栓極大可能誤入頸內(nèi)動(dòng)脈上唯一的分支翼腭動(dòng)脈，此時(shí)需要將線栓緩緩抽回，調(diào)整角度后重新插入。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將線栓反復(fù)調(diào)整角度，仍極易插入翼腭動(dòng)脈，考慮可能由于線栓本身彎度引起誤插，此時(shí)建議換取新線栓再次插入，這也是制備該模型最常見(jiàn)的失敗原因，需要術(shù)者付之耐心與細(xì)心。

4.4 縫合

術(shù)后縫合關(guān)于多余線栓的處理一般有2種，一種是埋在大鼠體內(nèi)，另一種是留在大鼠體外。將線栓埋在體內(nèi)是為了避免麻醉不充分的大鼠術(shù)后過(guò)度活動(dòng)導(dǎo)致線栓脫出而致模型失敗，但在拔線栓時(shí)，需要再次暴露和二次縫合切口。筆者發(fā)現(xiàn)大鼠麻醉逐漸蘇醒過(guò)程中活動(dòng)量明顯減小，在操作中采用將多余線栓留于體外的方法，同時(shí)將線栓用記號(hào)筆涂黑標(biāo)記便于識(shí)別。

5 術(shù)后再灌

國(guó)內(nèi)研究者在術(shù)后24 h分別對(duì)腦缺血后30 min、60 min和90 min再灌注大鼠進(jìn)行梗死面積評(píng)估，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血后30 min再灌注損傷較輕；缺血后60 min基底核損傷較前者重，皮質(zhì)有很輕微改變或無(wú)改變，病變不恒定；而缺血后90 min再灌注則在額頂葉皮質(zhì)及基底核區(qū)形成面積相對(duì)恒定的梗死灶，術(shù)后神經(jīng)缺損表現(xiàn)明顯[18]，能夠較好地模擬人腦局灶缺血后狀態(tài)。國(guó)外研究者亦多采用缺血后90 min作為缺血再灌注損傷模型[19]。因此，筆者選擇缺血后90 min再灌注，在大鼠體外傷口縫合處找到線頭，輕輕拔出線栓2～3 cm剪斷，若此時(shí)大鼠已完全清醒，可注射少量麻藥后再將線栓拔出，以防拔線栓時(shí)大鼠過(guò)度掙扎加大損傷。

6 術(shù)后護(hù)理與并發(fā)癥

術(shù)后更換干凈墊料并將大鼠放回鼠籠，用60N白熾燈距離大鼠25～35 cm處持續(xù)照射直至其蘇醒后再撤除，期間可將大鼠頭部微微墊高，以防側(cè)枝循環(huán)過(guò)快恢復(fù)。大鼠在術(shù)后1～3 d內(nèi)并發(fā)癥多，死亡率高，最常見(jiàn)的死亡原因包括：腦水腫；插線栓時(shí)用力過(guò)猛刺破血管致蛛網(wǎng)膜下腔出血；術(shù)中損傷迷走神經(jīng)致呼吸抑制。因此，術(shù)者在操作中一定要?jiǎng)幼鬏p柔靈活，切不可使用蠻力。眼部感染和癲癇是術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，筆者使用金霉素眼膏在眼部感染處進(jìn)行外涂，1次/d，3～5 d可緩解；癲癇是由于腦缺血致?lián)p傷神經(jīng)元過(guò)多引起神經(jīng)元異常放電，癲癇大鼠均不納入實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，筆者密切關(guān)注大鼠飲水量變化，對(duì)于術(shù)后極度虛弱，飲水量明顯減少的大鼠，可予1%葡萄糖水灌胃，5 mL/只，2次/d，防止大鼠營(yíng)養(yǎng)不良而致死亡。另外，應(yīng)盡量保持墊料干燥，每日更換墊料，控制室溫在25°C左右，可將食物放于籠中便于攝取，避免籠中大鼠只數(shù)過(guò)度、密度過(guò)高，這些因素均有利大鼠術(shù)后恢復(fù)。

7 模型評(píng)價(jià)

MCAO模型評(píng)價(jià)方法有多種，如神經(jīng)功能評(píng)分、TTC染色、腦組織含水量、局部腦血流測(cè)定和頭顱磁共振等。其中腦血流測(cè)定和頭顱磁共振檢查需要特定的儀器設(shè)備，費(fèi)用高昂，其應(yīng)用具有一定局限性。TTC染色和腦組織含水量測(cè)定需要處死大鼠，能夠直觀地了解大鼠腦缺血情況，且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易行，是MCAO模型最常用的評(píng)價(jià)方法。神經(jīng)功能評(píng)分包括Bederson評(píng)分、Belayev評(píng)分、Clark評(píng)分等，其中Bederson評(píng)分是引用頻率最高的神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[20]。神經(jīng)功能評(píng)分法直觀、簡(jiǎn)便，可以從整體角度觀察動(dòng)物神經(jīng)損傷程度，無(wú)需借助特殊儀器設(shè)備，但相對(duì)于其他評(píng)價(jià)方法，該法主觀、粗糙，無(wú)法準(zhǔn)確描述神經(jīng)損傷及恢復(fù)情況，故應(yīng)用時(shí)，常常聯(lián)合TTC染色和腦組織含水量測(cè)定評(píng)估模型而不將神經(jīng)功能評(píng)分作單獨(dú)使用。

8 結(jié)語(yǔ)

線栓MCAO模型的制備是目前研究腦缺血疾病最重要的手段之一，該模型也在不斷完善與改進(jìn)中。在模型制備中大體需要注意以下幾點(diǎn)：①一般選用260～280 g SD雄性大鼠作為動(dòng)物模型；②合理選用麻醉藥物，現(xiàn)配現(xiàn)用，嚴(yán)格掌握藥物不良反應(yīng)與麻醉劑量；③手術(shù)操作規(guī)范化，采用合適的線栓，注意線栓插入的角度、深度與走向；④常采用缺血后90～120 min再灌注；⑤注意術(shù)后護(hù)理與并發(fā)癥的發(fā)生；⑥選擇合理的模型評(píng)價(jià)方法。在MCAO模型制備中，筆者發(fā)現(xiàn)該模型存在著一些局限性，包括同一體重范圍的大鼠血管構(gòu)造存在差異，導(dǎo)致線栓插入相同角度和深度，卻造成不同程度的神經(jīng)功能缺損；大鼠耐受性的不同會(huì)造成手術(shù)后缺血程度的不同。MCAO大鼠模型制備是一類精細(xì)手術(shù)，每一個(gè)環(huán)節(jié)都需要認(rèn)真仔細(xì)的對(duì)待，作為腦缺血研究的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，必須重視操作的每一個(gè)步驟，反復(fù)練習(xí)，同時(shí)不斷地總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，這樣才能提高M(jìn)CAO模型制備的成功率。

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