周夢(mèng)婷，陳子云，杜照奎，3，*，周斌，余敏

（1.臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江臺(tái)州318000；2.浙江省鎮(zhèn)海中學(xué)，浙江寧波315200；3.浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臺(tái)州318000；4.浙江百花園林集團(tuán)有限公司，浙江臺(tái)州318050）

田菁Sesbania cannabina（Retz.）Poir為豆科田菁屬一年生草本植物，又名堿菁、澇豆，喜溫暖的氣候，常見(jiàn)于我國(guó)南方省市[1]。田菁有較強(qiáng)的抗旱能力[2]，同時(shí)也耐鹽[3-4]、耐堿[5]、耐澇[6-7]、耐瘠薄[8-9]、耐重金屬[10]，適應(yīng)性廣。長(zhǎng)期以來(lái)，田菁一直作為改良鹽堿土和培肥土壤的先鋒綠肥作物[11]。

田菁生長(zhǎng)迅速、生物量大，蛋白質(zhì)含量十分豐富，可作牧草配合飼料飼養(yǎng)動(dòng)物[12]。此外，一般的豆類(lèi)蛋白質(zhì)和谷類(lèi)蛋白質(zhì)相比較，更易消化吸收，更加健康符合人類(lèi)需求[13]，且含多種維生素及礦物質(zhì)[14]，也可作為人類(lèi)飲食的蛋白質(zhì)補(bǔ)充，可改善膳食結(jié)構(gòu)。目前，對(duì)于田菁蛋白質(zhì)分離提取的研究鮮有報(bào)道，因而其蘊(yùn)含的豐富蛋白質(zhì)并未得到充分利用。本研究以田菁葉片為原料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究其蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件，旨在提高田菁的資源利用率，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用田菁資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田菁葉片粉末的制備

田菁葉片采自臺(tái)州學(xué)院椒江校區(qū)校園內(nèi)，80℃干燥8 h后用粉碎機(jī)粉碎成粉末，所得粉末用廣口瓶收集，密封置于陰涼處備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

稱(chēng)取10 mg的牛血清白蛋白固體（BSA）加蒸餾水定容至100 mL，此溶液即為試驗(yàn)所用的0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。在6支試管中加入0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，再依次加入蒸餾水 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL。再分別加入3 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑并蓋塞混勻。放置2 min后，在595 nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[15]。以蛋白質(zhì)濃度（x）對(duì)吸光度（y）作出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程：y=8.533 1x-0.008 0（R2=0.991 4），結(jié)果表明總蛋白濃度在0.01 mg/mL～0.1 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.3 單因素試驗(yàn)對(duì)田菁葉片蛋白提取條件的優(yōu)化

1.3.1 提取時(shí)間對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按1：30（g/mL）的料液比加水（pH 值為 6），再加入 NaCl粉末，使其濃度為4%，于50℃水浴鍋中分別提取30、60、90、120、150、180 min。提取液于 6 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液1mL置具塞玻璃試管中，加入考馬斯亮藍(lán)試劑3 mL，并蓋上塞子，混勻，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算1 mL提取液和總體積提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 pH值對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按料液比 1 ∶30（g/mL）分別加水，pH 值分別為 2、4、6、8、10、12，再加入NaCl粉末，使其濃度為4%，于50℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.3 料液比對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，分別按料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）比例加水（pH值為6），再加入NaCl粉末，使其濃度為4%，于50℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6000r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.4 提取溫度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按1∶30（g/mL）的料液比加水（pH 值為 6），再加入 NaCl粉末，使其濃度為 4%，分別于 30、40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.5 鹽濃度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1g田菁葉片粉末，置于潔凈燒杯中，按料液比 1∶30（g/mL）比例加水（pH 值為 6），再加入 NaCl粉末，使其濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，于50℃水浴鍋中提取90 min。提取液于6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液1 mL置具塞玻璃試管中，其余操作同上。

1.3.6 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化田菁葉片蛋白的提取條件

在提取時(shí)間、pH值、液料比、溫度和鹽濃度5個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用五因素四水平進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)6次，以確定田菁總蛋白提取的最佳方案，因素水平如表1所示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 13.0對(duì)蛋白提取量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用Duncan新復(fù)極差檢驗(yàn)法對(duì)提取量進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響

提取時(shí)間對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖1所示。

由圖1可知，蛋白質(zhì)含量隨著提取時(shí)間的增加先增加后降低，當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，蛋白質(zhì)含量為28.98 mg/g，之后含量緩慢下降?？赡艿脑蚴翘崛r(shí)間過(guò)短，蛋白質(zhì)還沒(méi)有完全從原料中溶解出來(lái)；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，高溫和強(qiáng)堿作用會(huì)使蛋白質(zhì)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，疏水基團(tuán)暴露、溶解度降低[16]。綜合產(chǎn)量和能耗兩方面原因考慮，初步確定提取時(shí)間90 min～180 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of extraction time on extraction yield of Sesbania leaf proteins

2.1.2 pH值對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響

pH值對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖2所示。

圖2 pH值對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of pH on extraction yield of Sesbania leaf proteins

由圖2可知，蛋白質(zhì)含量隨著pH值的增加先顯著增加，到pH=6時(shí)，含量最大，值為32.51 mg/g；隨后，蛋白質(zhì)含量隨pH值的升高而顯著降低。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)為兩性電解質(zhì)，在某一pH值的溶液中它所帶的正電荷數(shù)與負(fù)電荷數(shù)恰好相等，即凈電荷數(shù)為零（此時(shí)pH值稱(chēng)為等電點(diǎn)），等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)間靜電斥力最低，蛋白質(zhì)溶解度最低，容易聚集、沉淀，從溶液中析出[17]；而較強(qiáng)的酸或堿會(huì)使蛋白質(zhì)脫氨、脫羧或水解，使得含量降低[18]。據(jù)此，初步確定提取pH值范圍為4～10。

2.1.3 料液比對(duì)田菁葉片蛋白含量的影響

料液比對(duì)田菁葉片蛋白含量的影響見(jiàn)圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)料液比較大時(shí)，蛋白質(zhì)含量隨料液比增大而顯著增加，料液比達(dá)到1∶30（g/mL）時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到峰值，蛋白質(zhì)含量為35.12 mg/g，之后又顯著下降。可能因?yàn)楫?dāng)溶劑量太小時(shí)，田菁葉片蛋白不能完全充分溶解，溶液中的蛋白質(zhì)少，所以含量過(guò)小，但是加溶劑量過(guò)大，則又會(huì)破壞提取效果[19]，而且使試驗(yàn)設(shè)備體積增大，大大降低了生產(chǎn)效率。因此，初步確定提取的料液比為 1∶20（g/mL）～1∶50（g/mL）。

圖3 料液比對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of material-to-liquid on extraction yield of Sesbania leaf proteins

2.1.4 提取溫度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響

提取溫度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction yield of Sesbania leaf proteins

由圖4可知，葉片蛋白含量隨提取溫度的升高而顯著增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時(shí)，蛋白質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到最高值30.35 mg/g。這是因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，蛋白質(zhì)較容易從原料中溶解出來(lái)，但溫度不是越高越好，高溫會(huì)使蛋白質(zhì)變性或裂解[20]，從而影響蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量。綜合能耗和產(chǎn)量考慮，初步確定提取溫度為30℃～60℃。

2.1.5 鹽濃度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響

鹽濃度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)鹽濃度為1%～5%時(shí)，葉片蛋白質(zhì)含量基本符合逐步上升的趨勢(shì)，當(dāng)鹽濃度為5%時(shí)，葉片蛋白值含量達(dá)到最高34.68 mg/g，超過(guò)5%后，提取含量有所下降。這可能是因?yàn)槿芤褐械拟c離子和氯離子可與帶負(fù)電荷和正電荷的蛋白質(zhì)基團(tuán)結(jié)合，屏蔽了蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥力，蛋白質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)時(shí)更容易交聯(lián)、聚焦而產(chǎn)生沉淀析出[21]。綜合含量和成本因素，初步確定鹽濃度為2%～5%。

圖5 鹽濃度對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of the concentration of NaCl on extraction yield of Sesbania leaf proteins

2.2 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的結(jié)果，設(shè)計(jì)L16（45）五因素四水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)6次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2正交設(shè)計(jì)及結(jié)果L16（45）Table 2L16（45）orthogonal design arrangement and experimental results

從表2可以看出，根據(jù)極差R的大小判斷得：田菁葉片蛋白質(zhì)提取含量影響因素的主次順序?yàn)镈＞A＞C＞E＞B，即提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比＞鹽濃度＞pH值。分析蛋白質(zhì)提取的含量和各因素的k值，A2B3C4D4E3組合為田菁葉片蛋白質(zhì)提取的最佳方案。

2.2.2 正交試驗(yàn)方差分析和多重比較結(jié)果

為考察5種因素對(duì)蛋白質(zhì)提取含量的差異，采用One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

由表3可知，因素A和D不同水平之間有顯著性差異，說(shuō)明提取溫度和提取時(shí)間對(duì)田菁葉片蛋白質(zhì)的提取率有顯著影響；因素B、C和E均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明pH值、料液比和鹽濃度在正交設(shè)計(jì)的4個(gè)水平對(duì)蛋白質(zhì)的提取率無(wú)顯著影響。

為了進(jìn)一步考察顯著因素不同水平間的差異，采用Duncan新復(fù)極差法分別對(duì)因素A和D進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 A和D兩因素四水平蛋白提取量均值的多重比較Table 4 Multiple comparisons of proteins extraction yield at different levels of factor A and D

由表4可知，A2和A3水平對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響顯著高于A1水平，但A2和A3之間差異不顯著，而選擇A2水平成本更低；D4水平顯著高于D2和D1水平，故選擇D4作為D因素的最適水平。

因素B、C和E因無(wú)顯著性差異，其水平可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，三者分別B3、C1和E1均較為合適。因此，最后確定提取田菁葉片蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為A2B3C1D4E1，即采用料液比1∶20（g/mL）、pH 8、NaCl 2%、60℃條件下提取120 min，即可達(dá)到最佳提取效果，在此條件下重復(fù)提取田菁葉片蛋白質(zhì)6次，測(cè)得平均提取率為40.02 mg/g。

3 結(jié)論

以水為溶劑，從田菁葉中提取蛋白質(zhì)，得到影響蛋白質(zhì)提取率的各個(gè)因素主次為提取溫度、提取時(shí)間、料液比、鹽濃度和pH值。從田菁葉中提取蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：料液比 1 ∶20（g/mL）、pH 8、NaCl 2%、提取溫度60℃，提取時(shí)間120 min。按該工藝參數(shù)組合提取田菁葉片蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)40.02 mg/g。

[1]張曉紅,鄒長(zhǎng)明,王允青,等.適宜在安徽推廣種植的田菁品種的篩選與評(píng)價(jià)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版),2015,41(2):190-195

[2]Srivastava N,Kumar G.Influence of drought stress on cytological behavior of green manure crop Sesbania cannabina Poir[J].Cytologia,2014,79(3):325-329

[3]Ren C G,Bai Y J,Kong C C,et al.Synergistic interactions between salt-tolerant rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi on salinity tolerance of Sesbania cannabina Plants[J].Journal of Plant Growth Regulation,2016,35(4):1098-1107

[4]張立賓,郭新霞,常尚連.田菁的耐鹽能力及其對(duì)濱海鹽漬土的改良效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(2):310-312

[5]Rao D L N,Gill H S.Biomass and biofertilizer production by Sesbania cannabina in alkaline soil[J].Bioresource technology,1995,53(2):169-172

[6]Li Y,Li X,Liu Y,et al.Genetic diversity and community structure of rhizobia nodulating Sesbania cannabina in saline-alkaline soils[J].Systematic and applied microbiology,2016,39(3):195-202

[7]謝文軍,王濟(jì)世,靳祥旭,等.田菁改良重度鹽漬化土壤的效果分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2016,32(6):119-123

[8]張俊彪,謝秒秒,張磊,等.田菁莖瘤固氮根瘤菌ORS571類(lèi)T3SS效應(yīng)蛋白的預(yù)測(cè)、原核表達(dá)及相關(guān)功能分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2017,25(3):461-469

[9]姜南,劉衛(wèi),李巖,等.莖瘤固氮根瘤菌趨化系統(tǒng)基因的比較基因組學(xué)分析及相關(guān)蛋白序列分析[J].微生物學(xué)報(bào),2016,56(8):1256-1265

[10]Sinha S,Gupta A K.Translocation of metals from fly ash amended soil in the plant of Sesbania cannabina L.Ritz:effect on antioxidants[J].Chemosphere,2005,61(8):1204-1214

[11]秦俊豪,溫瑩,李君菲,等.綠肥植物田菁的化感效應(yīng)及對(duì)土壤肥力的影響[J].土壤,2015,47(3):524-529

[12]李福嶺.田菁的飼料利用價(jià)值及飼喂試驗(yàn)[J].飼料研究,1993(5):30-31

[13]張艷,朱珠,張傳智,等.黑豆餅粕蛋白的超聲波提取及其性質(zhì)的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2014,35(24):49-53

[14]張亞格,李茂,周漢林,等.豆科牧草在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2016,37(5):73-77

[15]葉婧,曾育蒙,王秀麗,等.腰果蛋白的提取及功能特性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2016,37(6):43-49

[16]楊芙蓮,趙麗娜.甜蕎麥麩皮蛋白質(zhì)提取工藝研究[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,35(1):126-130

[17]劉宇,劉暢,楊杰,等.橡膠籽分離蛋白的組成及功能性質(zhì)[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2016,31(5):61-65

[18]孔維寶,侯明杰,李萬(wàn)武,等.文冠果油渣中蛋白質(zhì)的提取工藝研究[J].中國(guó)油脂,2014,39(7):42-45

[19]楊曉明,安峰峰,張雅倩.三葉草可溶性蛋白提取工藝研究[J].甘肅科技,2014,30(23):146-148

[20]趙晨霞,祝海娟,張翌楠.正交試驗(yàn)優(yōu)化大麥蟲(chóng)蛋白質(zhì)提取工藝[J].食品科學(xué),2013,34(16):42-45

[21]邵瑤瑤,趙燕,徐明生,等.金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)凝膠化行為的影響研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2017,38(5):299-304