劉志剛，劉偉，余磊，謝曉林，劉曉燕，高蓬明，馬和喬

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng)550005）

甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）又稱甲基托布津，屬于高效、低毒殺菌劑，具有內(nèi)吸和預(yù)防作用，廣泛用于治療各種經(jīng)濟(jì)作物的白粉病、菌核病、灰霉病等，對(duì)人體有潛在致甲狀腺癌的危害。異菌脲（Iprodione）又稱撲海因，是廣譜保護(hù)性殺菌劑，可以防治各種作物的黑穗病、黑痣病、赤星病等病害，其能在人體的胃內(nèi)產(chǎn)生硝化反應(yīng)，形成硝基化合物而使人中毒。

獼猴桃富含多種營(yíng)養(yǎng)素，具有增強(qiáng)免疫力、預(yù)防心腦血管疾病等多種生理活性功能，享有“水果之王”的美譽(yù)[1]，是近年來(lái)貴州省重點(diǎn)發(fā)展的特色農(nóng)產(chǎn)品之一。獼猴桃在生長(zhǎng)過(guò)程中極易侵染軟腐病，導(dǎo)致在貯藏過(guò)程中發(fā)病，造成大量爛果，軟腐病已成為我國(guó)獼猴桃主產(chǎn)區(qū)種植業(yè)發(fā)展的重要制約因素[2]。病理研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃軟腐病的主要致病菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和擬菌點(diǎn)霉菌（Phomopsissp．）[3]，該病害侵染時(shí)期為花期和坐果期，主要途徑為疏花、疏果后害蟲(chóng)造成創(chuàng)口侵染，目前主要采用甲基硫菌靈和異菌脲等農(nóng)藥進(jìn)行防控，但過(guò)量的甲基硫菌靈和異菌脲會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在的危害。有文獻(xiàn)報(bào)道了采用紫外分光光度法、HPLC法和LC-MS法分別對(duì)甜瓜等果蔬中的甲基硫菌靈和異菌脲進(jìn)行了含量測(cè)定[4-11]，目前鮮見(jiàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用乙腈渦旋提取樣品，建立了快速、專屬的HPLC法同時(shí)測(cè)定獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量，對(duì)獼猴桃鮮果及相關(guān)加工產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃樣品采自貴州省修文縣龍場(chǎng)鎮(zhèn)平灘村“貴長(zhǎng)”獼猴桃種植基地。

甲基硫菌靈（HPLC級(jí)）：上海阿拉丁股份有限公司（Lot：F1228011）；異菌脲（HPLC 級(jí)）：百靈威科技有限公司（Lot：24904）；乙腈和甲醇（色譜純）：美國(guó) Tedia公司；甲酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-15C型高效液相色譜儀、配二極管陣列檢測(cè)器、Labsolution色譜工作站、AUW-120D型電子天平、UV2700型紫外可見(jiàn)光光譜儀：日本島津公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16A型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；SHA-B型恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司。

1.3 樣品制備方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品0.010 2 g，加乙腈溶解并定容至100 mL量瓶，即為甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)貯備液。另準(zhǔn)確稱取異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品0.010 5 g，加乙腈溶解并定容至100 mL量瓶，即為異菌脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精密量取甲基硫菌靈和異菌脲儲(chǔ)備液各8.0 mL，用乙腈稀釋成濃度分別為8.16 μg/mL和8.40 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.2 供試品溶液制備

將獼猴桃表皮及果肉分離，稱取果肉5.0g于25mL PE離心管中，分別加入10 mL乙腈，渦旋30 s，在常溫下超聲20 min后將離心管在離心機(jī)上（10 000 r/min）離心5 min，再加入5 mL乙腈洗殘?jiān)?，合?次提取液并用乙腈定容至25 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.4 HPLC色譜條件

色譜柱 Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動(dòng)相為乙腈∶0.05%甲酸水溶液=60∶40（體積比），等濃度洗脫，柱溫為30℃；進(jìn)樣體積 20 μL；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取濃度分別為10.2 μg/mL和10.5 μg/mL的甲基硫菌靈和異菌脲混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，依次稀釋成濃度為 0.204、0.510、1.02、2.04、5.10、10.2 μg/mL 和0.210、0.525、1.05、2.10、5.25、10.5 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），得到甲基硫菌靈回歸方程為y=99 684x-7 643.1（R2=0.999 2），異菌脲回歸方程為y=141 238.835 6x-6 868.9（R2=0.999 7）。

圖1 甲基硫菌靈和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of thiophanate-methyl and iprodione

2.2 精密度試驗(yàn)

取濃度分別為8.16 μg/mL和8.40 μg/mL的甲基硫菌靈和異菌脲混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.4色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，甲基硫菌靈和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品代表色譜圖見(jiàn)圖2。甲基硫菌靈的峰面積分別為997 251、999 082、991 500、997 857、974 397 和 978 238，異菌脲的峰面積分別為 1 412 693、1 413 582、1 403 610、1 408 569、1 381 034和1 393 262，計(jì)算得RSD分別為1.04%和0.95%，說(shuō)明方法精密度良好。

圖2 甲基硫菌靈和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatograms of thiophanate-methyl and iprodione standard

2.3 檢出限

分析方法的檢出限為3倍S/N時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析物濃度，經(jīng)試驗(yàn)并按實(shí)際樣品的處理過(guò)程計(jì)算得到甲基硫菌靈和異菌脲的檢測(cè)限均為0.05 μg/g。

2.4 回收率與重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取未施用甲基硫菌靈和異菌脲的獼猴桃樣品6份，分別按照3個(gè)濃度準(zhǔn)確加入甲基硫菌靈和異菌脲對(duì)照品各3份，按照1.3.2方法制備供試品溶液，獼猴桃樣品添加甲基硫菌靈和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品代表色譜圖見(jiàn)圖3。計(jì)算加樣回收率，甲基硫菌靈和異菌脲回收率結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2，結(jié)果表明所建立方法的回收率和重復(fù)性較好。

圖3 獼猴桃樣品添加甲基硫菌靈和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Chromatograms of kiwifruit sample added with thiophanate-methyl and iprodione standard

表1 甲基硫菌靈回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of recovery of thiophanate-methyl

表2 異菌脲回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of recovery of iprodione

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取甲基硫菌靈和異菌脲混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，在室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12 h 后，在確定的色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定甲基硫菌靈和異菌脲的色譜峰面積，分別計(jì)算RE值，由表3中結(jié)果可知，甲基硫菌靈和異菌脲溶液在室溫下放置12 h穩(wěn)定。

表3 甲基硫菌靈和異菌脲穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of stability of thiophanate-methyl and iprodione

2.6 樣品測(cè)定

按上述樣品前處理方法和高效液相色譜條件，對(duì)采自貴州省修文縣龍場(chǎng)鎮(zhèn)平灘村“貴長(zhǎng)”獼猴桃種植基地的6個(gè)不同批次“貴長(zhǎng)”獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲兩種農(nóng)藥的HPLC測(cè)定方法，甲基硫菌靈和異菌脲的檢出限均為0.05 μg/g，方法的專屬性和準(zhǔn)確度良好，能夠用于檢測(cè)獼猴桃樣品中上述兩種農(nóng)藥的殘留。對(duì)采自貴州省修文縣龍場(chǎng)鎮(zhèn)平灘村“貴長(zhǎng)”獼猴桃種植基地的6個(gè)不同批次“貴長(zhǎng)”獼猴桃中甲基硫菌靈和異菌脲含量進(jìn)行檢測(cè)（該批次獼猴桃均采用甲基硫菌靈和異菌脲防控軟腐?。?，結(jié)果均未檢出，檢測(cè)結(jié)果表明，采用甲基硫菌靈和異菌脲防控制獼猴桃軟腐病造成獼猴桃果實(shí)中上述兩種農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)較小。

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