李 君，鄧紅雨 ，張景鋒 ，侯霞飛，羅 軍

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州市反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

上游刺激因子（upstream stimulatory factor，USF）是一類(lèi)具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（b-HLHLZ）結(jié)構(gòu)的多功能轉(zhuǎn)錄因子，主要包括USF1和USF2兩種亞型。USF對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子中的E-box結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的，而E-box元件在真核細(xì)胞基因組中大量存在，所以USF是一類(lèi)多功能轉(zhuǎn)錄因子。已有的研究表明，USF1參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、糖脂代謝及排卵等生化過(guò)程［1-2］。USF1調(diào)控糖類(lèi)和脂肪代謝基因的表達(dá)［3-4］，在雞的小腸上皮細(xì)胞中，USF1調(diào)控糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)［5］。在脂肪代謝過(guò)程中，它調(diào)控載脂蛋白基因、脂肪酸合成酶、乙酰COA羧化酶、激素敏感脂肪酶的表達(dá)［6-7］。因此，USF1基因在細(xì)胞糖類(lèi)和脂類(lèi)代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

乳腺組織是動(dòng)物體內(nèi)合成和分解脂肪的重要組織，泌乳期間乳腺脂肪的合成能力非常旺盛。研究奶山羊USF1基因可了解乳腺組織中脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)理，從而可對(duì)提高山羊的生產(chǎn)性能以及改善山羊乳品質(zhì)產(chǎn)生重要意義。目前，關(guān)于USF1在乳腺組織中的研究還鮮有報(bào)道。對(duì)于山羊USF1基因的序列大部分還只是預(yù)測(cè)，而且其表達(dá)規(guī)律還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

本研究旨在克隆奶山羊USF1基因編碼區(qū)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過(guò)檢測(cè)USF1基因在不同泌乳時(shí)期乳腺組織中的表達(dá)量，分析USF1在泌乳過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，為初步探討USF1基因在奶山羊乳腺組織中的功能及對(duì)脂質(zhì)代謝基因的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能奶山羊原種場(chǎng)。樣品采集的方法、流程和注意事項(xiàng)參考孫雨婷等［8］。選用體況良好、胎次相同、泌乳天數(shù)相近的奶山羊3只，分別采集泌乳前期（15 d）、盛期（60 d）、中期（120 d）和干奶期（331 d）的乳腺組織。用DEPC滅菌水反復(fù)清洗后，迅速放入已含有Trizol試劑的無(wú)RNase的離心管中，投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DEPC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD-19T載體、大腸桿菌（Escherichia coli）TOP 10感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；T4DNA連接酶、DNA限制性?xún)?nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT Reagent Kit、LA Taq DNA聚合酶和實(shí)時(shí)定量試劑盒均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司（TaKaRa）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì) GenBank中牛（NM_001001161）、人（NM_007122）和豬（NM_001190245）等物種的USF1基因進(jìn)行同源性比對(duì)，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件在保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性克隆引物，上游引物序列：5’-GACCAGTTCCTCGGATGTGC-3’；下游引物序列：5’-TGTGGCTCCTGGGCTATCTG-3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RNA提取與cDNA的合成

采用Trizol一步法提取羊乳腺組織總RNA，具體操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)［9-10］。按照 Takara公司PrimeScriptRT reagent Kit說(shuō)明書(shū)操作，將檢測(cè)合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 山羊USF1基因的克隆與測(cè)序

對(duì)USF1基因CDS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30 s，64℃退火 30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)正確的目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取多個(gè)白色菌落擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.6 奶山羊USF1基因的生物信息學(xué)分析

奶山羊USF1與不同物種間序列比對(duì)方法及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)參照文獻(xiàn)［11］。利用NCBI中的Blastn和Blastp（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析奶山羊 USF1基因核苷酸及其編碼的氨基酸序列與牛、小鼠和人的差異；通過(guò)BioXM2.6軟件對(duì)USF1的氨基酸序列進(jìn)行物種間多重比對(duì)；利用 ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測(cè)奶山羊USF1蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)。通過(guò)TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、ExPASy 中的 ProtScale 程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）、Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分別對(duì)USF1進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)疏水性和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。利用 cNLS Mapper（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgibin/NLS_Mapper_form.cgi）對(duì)USF1的核定位信號(hào)分析預(yù)測(cè)。

1.7 奶山羊USF1基因的組織表達(dá)分析

以GAPDH、UXT為內(nèi)參基因，每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)加樣重復(fù)，采用 2-△△Ct法進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)的結(jié)果分析［12］?；?qū)崟r(shí)定量引物如表1。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊USF1基因的克隆與測(cè)序

從奶山羊乳腺組織中擴(kuò)增得到大小約1 000 bp的片段。測(cè)序結(jié)果表明，山羊USF1基因序列1 030 bp。分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼區(qū)序列為933 bp，編碼310個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。提交到GenBank，登錄號(hào)為 MF953285。

2.2 奶山羊USF1基因的序列分析

由圖1可知，奶山羊USF1基因CDS區(qū)核苷酸序列與GenBank中牛、豬和人等物種的USF1基因的相似性分別為98%、95%、94%；編碼氨基酸序列的相似性為99%。

圖1 奶山羊與牛、豬、人USF1序列的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

USF1的蛋白質(zhì)分子量為33.497 kD，理論等電點(diǎn)為5.36。生物信息學(xué)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，USF1不存在跨膜結(jié)構(gòu)；其疏水性最大值1.5，最小值-3.367，分別位于第35 aa和第197 aa處。奶山羊USF1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，USF1的核定位信號(hào)（RDEKRRAQH）存在于氨基酸序列內(nèi)部，在USF1的196位aa處，且這部分氨基酸位于USF1的DNA結(jié)合域內(nèi)。

2.3 奶山羊USF1基因不同泌乳時(shí)期乳腺組織的表達(dá)分析

以GAPDH和UXT為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)奶山羊USF1基因在不同泌乳時(shí)期（泌乳前期、盛期、中期）和干奶期乳腺組織的mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明，USF1基因在不同泌乳期的mRNA表達(dá)量均顯著高于干奶期（P＜0.05），其中USF1在泌乳中期的表達(dá)量又顯著高于泌乳初期（P＜0.05）和盛期（P＜0.05）（圖2）。

圖2 奶山羊不同泌乳時(shí)期乳腺組織USF1基因的mRNA表達(dá)

3 討論

USF1是一種屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（b-HLH-LZ）家族的轉(zhuǎn)錄因子，它以二聚體形式在細(xì)胞核中與靶基因啟動(dòng)子上的E-box（核心序列為5'CACGTG3'）特異性結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［13］。前人的研究表明，USF1參與調(diào)控脂質(zhì)代謝。為了進(jìn)一步研究奶山羊乳腺脂肪酸合成過(guò)程中是否有USF1參與，本研究克隆了奶山羊USF1基因編碼區(qū)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究其在山羊不同泌乳階段乳腺組織中的表達(dá)變化情況。

3.1 奶山羊USF1基因的克隆

USF最早是從Hela細(xì)胞核提取物中部分純化出的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，USF可以使腺病毒晚期啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)10～20倍，故亦稱(chēng)晚期轉(zhuǎn)錄因子。USF有2個(gè)變異體：USF1和USF2，均隸屬于b-HLH-LZ轉(zhuǎn)錄因子家族，但分別由不同的基因轉(zhuǎn)錄。人的USF1基因定位于chr1q22～q23，總長(zhǎng)4 kb，共有10個(gè)外顯子，編碼310氨基酸殘基，USF2基因定位于chr19q23，全長(zhǎng)10 kb，也含有10個(gè)外顯子，編碼346氨基酸殘基，而鼠類(lèi)動(dòng)物的USF2則是在chr7上［14-15］。豬的USF1基因包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子［16］。除完整的USF1外，目前在小鼠中還發(fā)現(xiàn)USF1的2種由于選擇性剪接而來(lái)的變體，它們分別編碼USF1的244個(gè)和49個(gè)氨基酸殘基，其功能尚不清楚。本研究克隆的奶山羊USF1編碼區(qū)序列933 bp，編碼310個(gè)氨基酸殘基，為完整的USF1編碼區(qū)序列，至于山羊USF1是否含有其他變體還不清楚。

3.2 奶山羊USF1基因的結(jié)構(gòu)分析

在真核生物中，USF廣泛表達(dá)且十分保守。人和鼠類(lèi)動(dòng)物USF1基因的編碼區(qū)中有91%的相似性，相應(yīng)蛋白質(zhì)中相似性達(dá)98%［17］；本研究中山羊USF1基因編碼區(qū)核苷酸序列與牛、豬和人等物種的USF1基因的相似性分別為98%、95%、94%；編碼氨基酸序列的相似性為99%；編碼區(qū)的高度保守性證實(shí)了所分離基因的正確性。前人研究表明，USF1和USF2在C端都具有b-HLH-LZ結(jié)構(gòu)域，其中，堿性區(qū)（BR）由外顯子8編碼，它與亮氨酸拉鏈（LZ）結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)USF與靶DNA的結(jié)合，螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）則介導(dǎo) USF 的二聚化［13-14］。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，奶山羊USF1具有典型的b-HLH-LZ結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，該區(qū)域在進(jìn)化中十分保守，提示該結(jié)構(gòu)具有重要的生物學(xué)功能。USF1與啟動(dòng)子中含有E-box基序的靶基因結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，表明該基因主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。人的USF1基因C端具有核定位信號(hào)（NLS），定位于細(xì)胞核中。本研究中，經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，奶山羊USF1蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，其核定位信號(hào)（RDEKRRAQH）存在于氨基酸序列內(nèi)部，且這部分氨基酸位于USF1的DNA結(jié)合域內(nèi)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

3.3 奶山羊USF1基因的組織表達(dá)與糖脂代謝

USF1可以和自身及其他USF蛋白形成同源或異源的二聚體，結(jié)合在靶基因啟動(dòng)子的E-box元件上而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［18-19］。研究證實(shí)，USF1是負(fù)責(zé)血脂血糖自身平衡的調(diào)節(jié)基因。多數(shù)研究表明，USF1在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在，它和細(xì)胞生長(zhǎng)以及糖脂代謝等生理過(guò)程密切相關(guān)［20-22］。USF1廣泛參與調(diào)控糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)［23］?，F(xiàn)已有研究表明，載脂蛋白 A5 基因（APOA5）在降低血漿甘油三酯水平上具有極其重要的作用，其作用機(jī)制為USF能結(jié)合到APOA啟動(dòng)子區(qū)的E-box上，進(jìn)而增強(qiáng)APOA5基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［4］。泌乳是奶山羊的主要生理特點(diǎn)，而乳腺組織又是泌乳時(shí)期脂質(zhì)代謝最為旺盛的組織之一，因此在研究USF1在泌乳過(guò)程中的作用之前，本研究檢測(cè)了USF1在奶山羊乳腺不同泌乳階段的組織表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在整個(gè)泌乳周期中上調(diào)表達(dá)，在泌乳期前期、盛期、中期的表達(dá)量顯著高于干乳期（P＜0.05），該結(jié)果預(yù)示了USF1可能在奶山羊泌乳過(guò)程中發(fā)揮著一定的生理功能，暗示USF1參與山羊乳腺泌乳過(guò)程中乳脂乳糖代謝的調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究首次克隆了奶山羊USF1基因，并對(duì)其在不同泌乳時(shí)期的乳腺組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，USF1在泌乳期的表達(dá)量顯著高于干奶期（P＜0.05），且在泌乳中期表達(dá)量顯著高于泌乳前期（P＜0.05）和盛期（P＜0.05）。研究結(jié)果為轉(zhuǎn)錄因子USF1在奶山羊乳腺中的功能及對(duì)乳脂乳糖合成的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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