白玲榮，楊佐青，陶金忠

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

灘羊是我國(guó)唯一生產(chǎn)名貴二毛裘皮的特有綿羊品種，以生產(chǎn)美觀、輕便、保暖、耐用的裘皮而著稱。因其特殊的地理生態(tài)環(huán)境的長(zhǎng)期自然選擇和人工選育，造就了寧夏灘羊集產(chǎn)肉、產(chǎn)毛、產(chǎn)皮為一體的名貴羊種，寧夏（鹽池）是我國(guó)灘羊的主產(chǎn)區(qū)，有“中國(guó)灘羊之鄉(xiāng)”的稱謂。在灘羊二毛期時(shí)（1月齡），其裘皮的特性更為突出，此時(shí)毛股長(zhǎng)而彎曲，毛穗自然下垂；毛纖維細(xì)長(zhǎng)均勻，光澤悅目，花案清晰，為寧夏五寶之一的“白寶”［1-2］。灘羊羊毛按其毛股花穗型的不同，將其分為不同的類型，其中最理想的為串字花、小串字花和軟大花等［3-6］。這些類型的羊毛在其花形結(jié)構(gòu)和毛型比例上都存在較大的差異，并且這些表型差異隨著二毛期灘羊日齡的增加逐漸減弱甚至消失［7］。因此，對(duì)于羊毛表型差異及其變化過程中差異蛋白研究具有非常重要的意義［8］。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料，對(duì)于羊毛差異蛋白研究的文獻(xiàn)相對(duì)較少，主要集中于對(duì)羊毛“發(fā)源地”——皮膚的研究。松杰等［9］建立了內(nèi)蒙古絨山羊皮膚蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜條件；楊潔等［10］對(duì)細(xì)毛羊皮膚組織中毛囊蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜條件進(jìn)行了摸索；付雪峰等［11］利用雙向電泳及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)不同羊毛纖維直徑細(xì)毛羊皮膚組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)94個(gè)差異表達(dá)蛋白；楊劍波等［12］成功地構(gòu)建了中國(guó)美利奴羊超細(xì)型和哈薩克羊皮膚組織間抑制性消減cDNA文庫，初步篩選出一批可能影響羊毛性狀的差異表達(dá)ESTs；高麗霞等［13］利用雙向電泳技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊全年12個(gè)月的皮膚毛囊蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，建立了毛囊發(fā)育周期蛋白質(zhì)圖譜，對(duì)圖譜進(jìn)行了差異蛋白比對(duì)，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)12種差異角蛋白；Flanagan等［14］用蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜技術(shù)對(duì)羊毛差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了分析研究；Plowman等［15］應(yīng)用凝膠和非凝膠技術(shù)對(duì)羊毛蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了探討，并對(duì)美利奴羊、洛姆尼羊和考利代羊的羊毛蛋白進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)旨在建立灘羊羊毛蛋白質(zhì)組的雙向電泳圖譜體系，為灘羊二毛彎曲的形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 灘羊羊毛樣品采自于寧夏鹽池灘羊選育場(chǎng)，剪取灘羊體側(cè)肩胛骨后緣處完整羊毛樣品［16］。

1.1.2 試劑 固相膠條、IPG buffer和礦物油購(gòu)自GE公司；碘乙酰胺（IAA）、二硫蘇糖醇（DTT）、硫脲、尿素、CHAPS、Tirs-HCl、30%聚丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED和甘油均購(gòu)自索萊寶公司。

1.1.3 儀器 等電聚焦儀，多通道垂直電泳，惠普透射掃描儀，低溫離心機(jī)，NW10UVE超純水系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 羊毛洗滌 將采集的羊毛先用Teric GN9于60℃洗滌2 min，再于40℃洗滌2 min，然后用40℃去離子水洗滌2 min，最后用60℃去離子水洗滌2 min，放置室溫過夜干燥。將干燥的羊毛用二氯甲烷洗滌2次，每次用時(shí)5 min；再用乙醇洗滌2次，每次用時(shí)5 min；最后用超純水洗滌 2 次，每次用時(shí) 5 min，室溫干燥［17-19］。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 尿素裂解法 將洗滌完畢的羊毛置于研缽中，加入液氮充分反復(fù)研磨至粉末狀。稱取10 mg羊毛樣品粉末溶于1 mL裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、65 mmol/L DTT、0.5%IPG buffer、1 mmol/L EDTA、40 mmol/L Tris）中，震蕩溶解 2 min，分裝并根據(jù) Bradford法［20-21］定量上樣，其余放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 TCA/丙酮沉淀法 將洗滌完畢的羊毛置于研缽中，加入液氮反復(fù)研磨成粉狀。稱取10 mg樣品粉末加入1mLTCA丙酮溶液中，放置4℃冰箱過夜。將樣品置于4℃低溫離心機(jī)中12 000×g離心30 min，棄上清，加入100%丙酮（β-巰基乙醇）震蕩洗滌5 min，于低溫離心機(jī)12 000×g離心20 min。再重復(fù)一遍上述的洗滌過程；然后用90%丙酮（β-巰基乙醇）再次震蕩洗滌5 min，于低溫離心機(jī)12 000×g離心20 min，棄上清，再次重復(fù)一遍90%的丙酮洗滌過程。最后棄上清并抽真空晾干。加入1 mL裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%的CHAPS、65 mmol/L 的 DTT、0.5%IPG buffer、1 mmol/L 的 EDTA、40 mmol/L Tris），充分裂解后，根據(jù)Bradford法定量的結(jié)果分裝，其余放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 被動(dòng)上樣 將GE預(yù)制的18 cm膠條（pH值為4～7，pH 值為 3～10）在室溫下平衡 15 min，進(jìn)行蛋白質(zhì)上樣（上樣量分別為 200 μg，400 μg，600 μg，800 μg），根據(jù)蛋白上樣體積加入一定量的水化液（8 M尿素，2%CHAPS，1%DTT，0.5%IPG buffer），使混勻上樣總體積為400 μL進(jìn)行水化上樣。將混勻的蛋白樣品加入到IPG-box水化盤中，膠面向下輕輕覆蓋混合液，避免氣泡的產(chǎn)生，蓋緊IPG-box，放置15℃下被動(dòng)水化18 h。

1.2.4 第一向等電聚焦 將水化完成的膠條放入等電聚焦儀中，然后將濾紙片放置在電極和膠條間，放置電極并加入適量礦物油防止溶液的揮發(fā)。設(shè)置等電聚焦程序：300 v 30 min線性，500 v 1 h快速，8 000 v 3 h線性，8 000 v 80 000 Vhr快速，500 v 12 h快速至結(jié)束；300 v 30 min線性，500 v 1 h快速，8 000 v 3 h線性，9 000 v 90 000 Vhr快速，500 v 12 h快速至結(jié)束。

1.2.5 第二向SDS-PAGE垂直電泳 將聚焦完成后的IPG膠條用5 mL的平衡液Ⅰ（6 M尿素、2%SDS、1.5 M pH值8.8 Tris-HCl、20%甘油和1%DTT），至于搖床平衡15 min，平衡后使用電泳緩沖液潤(rùn)洗，再將膠條置于干凈水化盤，再加入平衡緩沖液Ⅱ（6 M尿素、2%SDS、1.5 M pH值8.8 Tris-HCl、20%甘油和4%IAA），放置于搖床平衡15 min。配制12%和10%的丙烯酰胺凝膠液并將其注入玻璃板夾層中，頂端留有1 cm左右的空間，用乙醇封面，以保持膠面平整。聚合時(shí)間1 h，待凝膠與上方液體分層時(shí)，表明凝膠已基本聚合。倒去SDS-PAGE凝膠頂端的乙醇，用超重水沖洗膠面。將平衡好的膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液室溫放置5 min，待徹底凝固后將其轉(zhuǎn)移至垂直電泳槽內(nèi)。向電泳槽中加入1×電泳緩沖液進(jìn)行第二向電泳，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳。取出凝膠，切角做記號(hào)。

1.2.6 凝膠染色及圖像分析 每次凝膠用新配的考馬斯亮藍(lán)染色12 h后，用去離子水脫色48 h至背景干凈，然后再用Images-Scanner掃描儀掃描，再用PD Quest 8.0軟件分析雙向電泳圖譜的蛋白點(diǎn)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白提取方法對(duì)羊毛雙向電泳的影響

羊毛蛋白質(zhì)制備作為其雙向電泳圖譜建立的關(guān)鍵步驟，直接影響后續(xù)條件的建立。本次實(shí)驗(yàn)以TCA/丙酮沉淀法和尿素裂解法兩種方法進(jìn)行蛋白提取。從TCA/丙酮沉淀法（圖1A）雙向電泳圖譜中可以得到相比較于尿素裂解法（圖1B）較多的蛋白點(diǎn)，在高豐度蛋白區(qū)可以較為明顯地看出，尿素裂解法溶解羊毛蛋白不夠充分，由于羊毛蛋白質(zhì)主要是由角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白組成，TCA/丙酮沉淀法較好地溶解了部分疏水性蛋白，提高了蛋白豐度和蛋白種類。選擇TCA/丙酮沉淀法作為灘羊羊毛蛋白質(zhì)的提取方法比較好。

圖1 不同蛋白提取方法灘羊羊毛雙向電泳圖譜

2.2 上樣量對(duì)羊毛雙向電泳的影響

雙向電泳的蛋白上樣量對(duì)雙向電泳圖譜蛋白點(diǎn)的檢測(cè)是十分關(guān)鍵的，為了研究適合于灘羊羊毛蛋白質(zhì)雙向電泳的上樣量，本實(shí)驗(yàn)選擇了200、400、600和800 μg四種蛋白上樣量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為200 μg（圖2C）時(shí)，只能得到高豐度蛋白，幾乎看不到低豐度蛋白；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為400 μg（圖2D）時(shí)，得到十分模糊的低豐度蛋白，不利于后期蛋白分析；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為600 μg（圖2E）時(shí)，高低豐度蛋白都有較清楚的分辨率；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為800 μg（圖2F）時(shí)，高豐度蛋白由于蛋白濃度過高，影響蛋白質(zhì)的聚焦。所以相比較其他上樣量，選擇以600 μg作為灘羊羊毛雙向電泳圖譜的最適上樣量。

2.3 不同pH范圍IPG膠條對(duì)羊毛雙向電泳的影響

本實(shí)驗(yàn)選擇同為18 cm pH值范圍為3～10和4～7的2種IPG膠條作為灘羊羊毛蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜條件的研究，從電泳圖譜中可清楚地看到，不同pH值范圍的IPG膠條對(duì)羊毛蛋白點(diǎn)的分布有較為明顯的影響，在pH值為4～7（圖3H）的圖譜中高豐度蛋白與低豐度蛋白都有較為清楚的分布；而pH值為3～10（圖3G）的圖譜中可直觀地看到其高豐度蛋白點(diǎn)出現(xiàn)堆積現(xiàn)象。因此，選擇pH值4～7作為灘羊羊毛雙向電泳的IPG膠條。

圖2 不同上樣量灘羊羊毛雙向電泳圖譜

圖3 不同pH值范圍的IPG膠條灘羊羊毛雙向電泳圖譜

3 討論

蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典方法，對(duì)蛋白質(zhì)分離可達(dá)到理想效果，在各組織蛋白組分離和差異蛋白研究方面起重要的技術(shù)支撐［22］。在進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳過程中涉及到許多步驟和因素，都對(duì)蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜結(jié)果有較大的影響，樣品的蛋白質(zhì)提取是進(jìn)行雙向電泳的關(guān)鍵步驟，蛋白提取方法的選擇是否合適，直接影響雙向電泳圖譜的分辨率和重復(fù)性及其后續(xù)差異蛋白點(diǎn)的鑒定。由于羊毛組織蛋白主要以角蛋白和羊毛結(jié)構(gòu)蛋白組成其特殊性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)TCA/丙酮沉淀法［23-25］和尿素裂解法提取灘羊羊毛蛋白質(zhì)的效果進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮沉淀法檢出的蛋白點(diǎn)數(shù)相比尿素裂解法有所增加，高豐度蛋白區(qū)蛋白點(diǎn)較為清晰，其原因可能是TCA/丙酮沉淀法反復(fù)沉淀洗滌羊毛蛋白，能較好地溶解某些疏水性蛋白，提高了蛋白豐度和蛋白種類，配合裂解液中高濃度的尿素和硫脲以及還原劑DTT、去污劑CHAPS等成分可增強(qiáng)羊毛蛋白的溶解，獲得較為理想的凝膠結(jié)果圖譜，得到清晰的蛋白點(diǎn)［26-27］。因此，選擇TCA/丙酮沉淀法作為灘羊羊毛蛋白質(zhì)的提取方法較為合適。

蛋白質(zhì)上樣量直接影響蛋白雙向電泳圖譜上蛋白點(diǎn)的分離效果，上樣量過低則導(dǎo)致低豐度蛋白不能被分離出來，上樣量過高則導(dǎo)致高豐度蛋白掩蓋部分分子量和等電點(diǎn)相近的低豐度蛋白，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致橫向拖帶［28］。本實(shí)驗(yàn)選擇 200、400、600、800 μg 四種不同上樣量進(jìn)行了灘羊羊毛蛋白圖譜上樣量的研究。當(dāng)上樣量為200 μg和400 μg時(shí)，只能得到模糊高低豐度蛋白，很明顯不能滿足蛋白上樣量的要求，不利于后期蛋白分析；當(dāng)上樣量為800 μg時(shí)，高豐度蛋白由于蛋白濃度過高，電泳圖譜蛋白出現(xiàn)聚焦現(xiàn)象，蛋白沒有得到有效的分析。相比較其他上樣量，600 μg時(shí)高低豐度蛋白都有較清楚的分辨率，羊毛蛋白得到較為理想的分離效果。因此，選擇以600 μg作為灘羊羊毛雙向電泳圖譜的最適上樣量。

雙向電泳IPG膠條的選擇主要根據(jù)羊毛蛋白的組成情況，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選擇18 cm的pH值為4～7和pH值為3～10的2種膠條。寬pH值范圍的膠條用來分析總蛋白，窄pH值范圍的膠條可以大大提高分辨率和靈敏度，用于分析特定的蛋白［29］。從得到的蛋白圖譜可以明顯地看出，pH值為4～7的蛋白點(diǎn)得到了有效的分離。鑒于后期對(duì)灘羊羊毛差異蛋白點(diǎn)的研究需要，所以選擇pH值相對(duì)較窄的、具有很好分辨率的pH值為4～7作為灘羊羊毛雙向電泳的膠條。

4 結(jié)論

對(duì)灘羊羊毛進(jìn)行洗滌，液氮研磨處理，利用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白，選擇18 cm的pH值為4～7的IPG膠條，上樣量600 μg，聚焦時(shí)間90 000 Vhr或更高，12%SDS-PAGE凝膠，建立灘羊羊毛雙向電泳圖譜體系，為灘羊不同時(shí)期羊毛和同一時(shí)期不同花穗型羊毛，以及灘羊羊毛與其他品種羊毛之間的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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