何佳鑫 趙 暉 張秋霞 齊 放 李君玲 張 楠 樊永平 李 明△ 王 蕾△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050）

多發(fā)性硬化（MS）是一種以炎癥反應(yīng)、軸突及神經(jīng)元的損傷為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾病［1］，易反復(fù)發(fā)作，且致殘率較高。軸突修復(fù)和再生是改善該病病情及恢復(fù)患者神經(jīng)功能的治療要點(diǎn)之一［2］。中樞神經(jīng)損傷后會(huì)立即啟動(dòng)一系列和形成瘢痕組織相關(guān)的細(xì)胞及分子間的反應(yīng)。膠質(zhì)瘢痕中生成大量的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，破壞神經(jīng)再生微環(huán)境，是導(dǎo)致軸突再生修復(fù)困難的重要原因［3］。硫酸軟骨素糖蛋白（CSPGs）是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)成分中的一類蛋白多糖，由星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)元分泌，在損傷區(qū)堆積，是瘢痕組織中影響神經(jīng)再生的最主要的抑制因子［4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)瘢痕的主要組成部分，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）為星形膠質(zhì)細(xì)胞的中間絲骨架蛋白，GFAP增強(qiáng)可提示星形膠質(zhì)細(xì)胞活化或反應(yīng)性膠質(zhì)增生，是膠質(zhì)瘢痕的重要標(biāo)志物［5］。目前西醫(yī)主要采用免疫抑制和調(diào)節(jié)的方法治療，對(duì)MS有一定的療效，但長(zhǎng)期大量應(yīng)用副作用大［6］，對(duì)神經(jīng)再生無(wú)安全有效的方法。樊永平教授通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，根據(jù)MS腎虛兼痰瘀的基本病機(jī)，在補(bǔ)腎化痰活血治法的指導(dǎo)下，創(chuàng)立了補(bǔ)腎益髓方［7］。大量臨床研究表明本方能夠改善MS患者神經(jīng)癥狀，減少其復(fù)發(fā)，提高了患者生存質(zhì)量［8］。筆者的前期研究顯示補(bǔ)腎益髓方能夠緩解實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的癥狀，改善其神經(jīng)功能評(píng)分，促進(jìn)受損后神經(jīng)的再生與修復(fù)［9］。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用劃痕法建立膠質(zhì)瘢痕模型，觀察補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)機(jī)械損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及GFAP和CSPGs表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，以及新生24 h的SD乳鼠，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。

1.2 試藥與儀器 補(bǔ)腎益髓方由生地黃、熟地黃、制首烏、浙貝母、水蛭、全蝎，益母草等組成；補(bǔ)腎方組方藥物主要有生地黃、熟地黃等；化痰活血方主要藥物有浙貝母、水蛭、全蝎等，以上各藥方由北京亞?wèn)|生物制藥有限公司制備成浸膏粉。DMEM-F12培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；青霉素及鏈霉素、胰蛋白酶及胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；多聚賴氨酸 （貨號(hào)P1399，美國(guó)Sigma公司）。CCK-8試劑盒由日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所提供；雞抗GFAP多克隆抗體（貨號(hào)ab4674）及Alexa Fluor647標(biāo)記的山羊抗雞IgY-H&L（貨號(hào)ab150171）均由美國(guó)abcam公司提供；小鼠抗CSPGs單克隆抗體 （貨號(hào)C8035）由美國(guó)Sigma公司提供；FITC488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（貨號(hào)ZF-0312）北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAPI（Southern Biotechg，貨號(hào)0100-20）。CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；激光共聚焦顯微鏡（LEICA TCSSP5）；高內(nèi)涵分析儀（Thermo 公司，型號(hào)ARRAY SCANxTI）

1.3 造模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將SD大鼠隨機(jī)分為4組各10只，空白血清組（等量蒸餾水），補(bǔ)腎益髓方組（13.48 g生藥/kg），補(bǔ)腎方組（6.36 g生藥/kg），化痰活血方組（7.04 g生藥/kg）。用蒸餾水將各組浸膏粉溶解，連續(xù)7 d灌胃，每日灌胃2次，間隔12 h。末次給藥后2 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4℃靜置4 h，離心吸取血清并將同組血清混勻，用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1）原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取、純化。取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠大腦皮層并剪碎成小塊，用0.125%胰蛋白酶消化5 min，以40 μm篩過(guò)濾消化液，1000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞并將細(xì)胞種到經(jīng)多聚賴氨酸包被過(guò)的T25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待形成單層細(xì)胞層，置于恒溫?fù)u床180 r/min搖2 h后，調(diào)轉(zhuǎn)速260 r/min震搖18 h，去除小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。換液后繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右，用0.125%胰酶消化傳代，傳代后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定純度達(dá)95%以上可用于實(shí)驗(yàn)。2）細(xì)胞分組及給藥方法。細(xì)胞分為正常對(duì)照（NC）組，模型（MO）組，2.5%補(bǔ)腎益髓方組，5%補(bǔ)腎益髓方組，10%補(bǔ)腎益髓方組，每組各設(shè)3個(gè)平行孔，取傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，用10 μL槍頭呈“十”字劃傷細(xì)胞層，盡量保持劃痕大小和范圍一致。NC組與MO組用空白血清處理，其余各組用不同濃度補(bǔ)腎益髓方含藥血清處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。篩選出合適的補(bǔ)腎益髓方的濃度后，再將細(xì)胞分為NC組，MO組，5%補(bǔ)腎益髓方組，5%補(bǔ)腎方組，5%化痰活血方組，造模及用藥方法同上，測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率及GFAP、CSPGs的表達(dá)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑法（CCK-8）測(cè)定細(xì)胞存活率。將星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后，經(jīng)劃痕處理，對(duì)照組與用藥組細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，混勻，培養(yǎng)箱中孵育1 h。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的光密度值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞存活率：（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）。2）高內(nèi)涵法測(cè)定補(bǔ)腎益髓方及拆方含藥血清對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs表達(dá)的影響。將細(xì)胞密度調(diào)整至8.5×105/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，劃痕并給予含藥血清處理24 h后，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，沖洗。0.3%Triton X-100破膜處理5 min，沖洗。3%BSA/PBS封閉30 min后，加入GFAP（1∶1000）及 CSPGs（1∶200）抗體 4℃孵育 18 h，沖洗。加入Alexa Fluor標(biāo)記山羊抗雞IgY-H&L抗體（紅色，1∶500）及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（綠色，1∶200）室溫避光孵育 1 h，清洗。用 DAPI室溫染核5 min，清洗。 最后以 100 μL/孔加入 0.01 mol/L PBS，應(yīng)用Cellomics ArrayScan XTI高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)對(duì)GFAP及CSPGs蛋白進(jìn)行測(cè)定和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度補(bǔ)腎益髓含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)表1。模型（MO）組細(xì)胞存活率與正常對(duì)照（NC）組相比顯著降低（P＜0.01），2.5%，5%，10%補(bǔ)腎益髓含藥血清組細(xì)胞存活率與MO組相比均有不同程度升高 （P＜0.05或 P＜0.01），而5%、10%補(bǔ)腎益髓含藥血清組優(yōu)于2.5%補(bǔ)腎益髓組 （P＜0.05），5%補(bǔ)腎益髓方組細(xì)胞的存活率還高于10%補(bǔ)腎益髓方組，故選取5%補(bǔ)腎益髓方含藥血清作為下一步實(shí)驗(yàn)用藥濃度。

表1 不同濃度補(bǔ)腎益髓方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

表1 不同濃度補(bǔ)腎益髓方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

與 NC 組比較， **P＜0.01； 與 MO 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與2.5%補(bǔ)腎益髓方組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n NC組 3 MO組 3 2.5%補(bǔ)腎益髓方組 3細(xì)胞存活率100.00±7.49 60.77±4.22**69.19±3.37#5%補(bǔ)腎益髓方組 3 78.98±3.89##△10%補(bǔ)腎益髓方組 3 77.51±1.44##△

2.2 補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)表2。MO組細(xì)胞存活率較NC組顯著降低（P＜0.01）。各治療組即全方及拆方含藥血清組細(xì)胞存活率與MO組相比，均有不同程度的上升（P＜0.01）。其中補(bǔ)腎益髓方組及補(bǔ)腎方組細(xì)胞存活率優(yōu)于化痰活血方組 （P＜0.05或 P＜0.01）。

表2 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

表2 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

組 別 n NC組 3 MO組 3補(bǔ)腎益髓方組 3細(xì)胞存活率100.00±1.28 64.17±1.98**85.18±3.28##△△補(bǔ)腎方組 3 81.50±1.14##△化痰活血方組 3 74.89±4.55##

2.3 補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP與CSPGs的影響見(jiàn)表3，圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果NC組免疫熒光染色顯示，GFAP均勻地分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞骨架。與NC組相比，MO組GFAP的平均光密度值較NC組顯著性增高（P＜0.01），且劃痕兩側(cè)GFAP熒光染色較非劃痕區(qū)增強(qiáng)，可見(jiàn)反應(yīng)性增生后聚集生長(zhǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞體增大，突起增粗、延長(zhǎng)并向劃痕中央?yún)^(qū)伸出。提示星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)劃痕后活化明顯。各用藥組與MO組相比，GFAP的平均光密度值有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組CSPGs的免疫熒光染色僅有少量表達(dá)，MO組CSPGs熒光染色表達(dá)增強(qiáng)呈強(qiáng)陽(yáng)性，且主要集中在劃痕兩側(cè)。MO組CSPGs的平均光密度值較NC組顯著性地增高（P＜0.01），各用藥組CSPGs的平均光密度值與MO組相比，均有所下調(diào) （P＜0.05或P＜0.01），其中補(bǔ)腎益髓方組CSPGs的平均光密度值與化痰活血方組比較，下降較為顯著（P＜0.05）。

表3 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs表達(dá)的影響（±s）

表3 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs表達(dá)的影響（±s）

組 別 n NC組 3 MO組 3補(bǔ)腎益髓方組 3補(bǔ)腎方組 3化痰活血方組 3 GFAP平均熒光密度值 CSPGs平均熒光密度值40.65±0.35 119.07±5.45 45.27±0.76** 154.68±4.48**44.30±0.59 134.52±6.03##44.68±0.10 142.68±2.76##44.89±0.92 143.31±2.95#△

圖1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs的表達(dá)變化（400倍）

3 討 論

GFAP對(duì)于維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其功能發(fā)揮方面有著重要作用。CNS受損后，損傷區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，GFAP表達(dá)量增多，不斷堆積成為膠質(zhì)瘢痕的主要組成部分［10-11］。相關(guān)研究表明，抑制GFAP的表達(dá)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生能夠減少膠質(zhì)瘢痕的寬度和密度，拮抗其對(duì)軸突再生的阻礙作用［12］。劃痕法為機(jī)械損傷屬于離斷模型的一種，能夠模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的機(jī)理反應(yīng)，是常用的細(xì)胞損傷模型之一，用于模擬中樞神經(jīng)受損后的研究［5］。此次實(shí)驗(yàn)中星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)劃痕后形態(tài)改變，劃痕兩側(cè)呈聚集生長(zhǎng)，GFAP、CSPGs兩種標(biāo)志性蛋白均顯著性地升高，表明膠質(zhì)瘢痕模型制作成功。補(bǔ)腎益髓方及其拆方對(duì)劃痕損傷后升高的GFAP的調(diào)控作用不明顯，表明補(bǔ)腎益髓方對(duì)膠質(zhì)瘢痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后活化及增生無(wú)明顯作用。

無(wú)論在動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)中均表明CSPGs在受損區(qū)域積聚呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，表現(xiàn)出了對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制性［13-14］。CSPGs可與許多神經(jīng)元表面受體結(jié)合，包括NgR1，NgR3，白細(xì)胞共同抗原相關(guān)蛋白（LAR），及其同系物 RPTP［15］，并通過(guò)激活 RhoA/ROCK信號(hào)通路，引起生長(zhǎng)錐塌陷，抑制軸突的生長(zhǎng)［16］。本團(tuán)隊(duì)此前實(shí)驗(yàn)研究表明，補(bǔ)腎益髓方及其拆方均能夠不同程度地下調(diào)EAE小鼠腦及脊髓部位CSPGs的表達(dá)且能夠減輕腦及脊髓部位軸突的損傷［9］。此次實(shí)驗(yàn)亦從體外方面證明了補(bǔ)腎益髓方及其拆方能夠抑制CSPGs的表達(dá)，尤以補(bǔ)腎益髓方效果為佳，與前期整體研究結(jié)果一致。

樊永平教授認(rèn)為中醫(yī)藥治療多發(fā)性硬化有明顯的優(yōu)勢(shì)，主要適用于緩解期，以促進(jìn)髓鞘的修復(fù)為主。他認(rèn)為多發(fā)性硬化主要病機(jī)為五臟失衡，腎虛髓空［17］。補(bǔ)腎益髓方重在補(bǔ)腎以扶正，佐以化痰活血袪邪。方中生地黃清熱涼血養(yǎng)陰，熟地黃、何首烏填精益髓；浙貝母、天麻清熱化痰熄風(fēng)；益母草、水蛭、全蝎活血祛瘀通絡(luò)，大黃、連翹清熱解毒散結(jié)。此次研究中補(bǔ)腎益髓方及其拆方均能促進(jìn)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活性，而補(bǔ)腎益髓方與補(bǔ)腎方優(yōu)于化痰活血方，可能與補(bǔ)腎益髓方以補(bǔ)腎藥物為主而補(bǔ)腎方藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有顯著地保護(hù)作用與修復(fù)作用有關(guān)［18］。補(bǔ)腎方與化痰活血方雖均可下調(diào)劃痕后的CSPGs，而補(bǔ)腎益髓方全方干預(yù)抑制因子CSPGs表達(dá)的效果優(yōu)于拆方補(bǔ)腎方與化痰活血方，說(shuō)明通過(guò)補(bǔ)腎藥物與化痰活血藥物配伍協(xié)同發(fā)揮作用更有助于促進(jìn)軸突的再生與修復(fù)。

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