趙忠琪 王曉坤 彭慧敏 梁家迪 王小晉 劉 暢*

1(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，長春 130021) 2(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣州 510140)

引言

軟骨組織是一種具有彈性的抗壓特殊結(jié)締組織，在體內(nèi)主要起到保護和支持的作用。軟骨組織內(nèi)無神經(jīng)、血管，細胞成分少，且組織較為致密，代謝活性低，因此軟骨組織修復(fù)再生能力差，損傷后常由軟骨膜形成的纖維結(jié)締組織替代修復(fù)。臨床上常見的由骨關(guān)節(jié)炎或外傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨缺損常表現(xiàn)為水腫、關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，未經(jīng)有效處理還可能引起進一步的組織降解，最終需要進行整體的關(guān)節(jié)置換。[1]目前，臨床上常用的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的外科治療手段包括：自體軟骨細胞移植、微骨折術(shù)、軟骨組織移植術(shù)、同種異體移植等。這些治療方法均存在不同程度的限制，例如:供體來源不足，免疫排斥反應(yīng)，生成的軟骨與天然組織的結(jié)構(gòu)、成分、機械強度差距較大，遠期效果不佳等[1-2]。

組織工程的出現(xiàn)和發(fā)展使得關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)替代物即人工構(gòu)建軟骨成為可能。生物支架材料是構(gòu)建人工軟骨的中心內(nèi)容之一，也是軟骨組織工程領(lǐng)域研究的熱點。常用的支架材料按其來源可分為天然生物材料、人工合成高分子材料和復(fù)合材料[4-5]。其中天然生物衍生材料來源于生物組織，與人工聚合材料相比，具有更好的生物相容性和生物識別優(yōu)勢，因而成為組織工程研究熱點。

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是一種特殊的天然生物衍生材料，主要通過理化方法去除組織或器官中的細胞及抗原成分所獲得。它是組織或器官脫細胞后剩余的結(jié)構(gòu)和功能蛋白的復(fù)合體，對于細胞黏著，細胞分化和細胞與生物材料之間的連接有著重要的作用[6]。近年來的研究表明，ECM能夠為細胞的生長提供組織特異性的微環(huán)境，并作為支撐細胞生長的三維支架結(jié)構(gòu)，提供化學(xué)信號和生物力學(xué)的信號，誘導(dǎo)和調(diào)控細胞的黏附、生長、增殖和分化，促進組織修復(fù)與再生而無須降解和去除[7-8]。

軟骨脫細胞基質(zhì)由于其特殊的制備方法及組織結(jié)構(gòu)特異性，相較于其他材料的孔隙率更低，調(diào)節(jié)手段也較為有限，加之軟骨組織的致密結(jié)構(gòu)，因此支架的細胞滲透性能成為軟骨脫細胞基質(zhì)材料發(fā)展中的難點?？紫堵逝c細胞滲透性是支架材料的重要評價指標，良好的孔隙率可以為細胞提供向深層增殖、遷移的途徑，促進細胞間的交流與相互作用，并提供營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運輸通路，維持細胞正常生存環(huán)境，保證組織工程移植物的成活。研究顯示，對各種生物工程支架材料(如人工聚合材料、天然生物衍材料)，可以通過改變支架的微觀結(jié)構(gòu)或成分配比等多種方法來調(diào)節(jié)孔隙率及孔徑[9-12]。相較而言，軟骨組織的調(diào)控方法則具有其特殊性。因此，本研究通過大量的文獻檢索，總結(jié)了目前針對調(diào)控軟骨脫細胞基質(zhì)支架孔隙率的實驗方法，對支架性能與調(diào)控方法之間的關(guān)系進行綜述。

1 軟骨細胞外基質(zhì)與脫細胞

軟骨細胞外基質(zhì)作為一種生物材料，其組織成份和結(jié)構(gòu)對種子細胞的生物學(xué)行為起著至關(guān)重要的作用。ECM的成分主要包括水、蛋白質(zhì)(膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、整合素等)、糖胺聚糖(GAGs)，以及生長因子和細胞因子。在軟骨基質(zhì)中，膠原蛋白占干重的95%，在組織中按照一定規(guī)律緊密排列，構(gòu)成微觀的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并承擔(dān)負荷。ECM的另一種主要成分是蛋白多糖(proteoglycans)，由GAGs裝飾核心蛋白構(gòu)成，具有促進細胞黏附、保持結(jié)締組織水分、調(diào)節(jié)物質(zhì)交換，增強組織抗壓性能等重要作用[47]。

然而，由于軟骨ECM 的致密組織結(jié)構(gòu)不能滿足種子細胞生長需求，且脫細胞(decellularization)過程中的化學(xué)試劑通常會導(dǎo)致ECM中蛋白多糖含量的降低。因此，有研究者在常規(guī)理化方法脫細胞的基礎(chǔ)上，對組織應(yīng)用軟骨素酶等酶制劑處理，徹底清除組織中的蛋白多糖，只保留構(gòu)成纖維網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)的膠原蛋白，以期望能夠獲得更高的孔隙率和細胞滲透性[15，48]。 這種方法在軟骨組織中的作用效果尚不明確，雖然能夠達到滿意的清除效果，但所提供的孔隙率仍然較低，因此需要進一步地研究與方案優(yōu)化。

由于酶法消化所提供的孔隙率十分有限，且蛋白多糖具有重要的生物化學(xué)和生物力學(xué)性能，因此將軟骨組織制備成軟骨顆粒成為了一種被廣泛應(yīng)用的方法。目前大多數(shù)研究在脫細胞處理前，要通過研磨或冷凍研磨的方法制取軟骨顆粒，這樣可以增大組織與試劑的接觸面積，降低脫細胞處理的難度，更容易獲得良好的脫細胞效果[11-14，17-18]。脫細胞處理后的軟骨顆粒經(jīng)過凍干成型技術(shù)，可以獲得具有相對較高孔隙率的支架。通過這種方法獲得的支架不影響其支持細胞附著和軟骨方向分化的特性，但犧牲了材料的機械性能，并且不能保持原有的天然組織的膠原結(jié)構(gòu)[15]。因此，仍然有許多研究者針對不粉碎的軟骨組織進行直接脫細胞處理，同時采取其他額外的手段增加支架孔隙率，促進細胞滲透。

2 濃度調(diào)控

在顆粒狀軟骨基質(zhì)凍干成型的過程中，支架的孔徑及孔隙率與細胞外基質(zhì)的濃度成反比，較低的濃度更利于廣泛地形成形狀不規(guī)則且互相連通的孔隙。同時，支架的機械強度則隨濃度的減小而降低。接種細胞后，低濃度支架相較于高濃度支架有更為明顯的細胞滲透。[12，16-18]研究顯示，不同濃度支架經(jīng)過細胞培養(yǎng)后，其機械性能的變化趨勢具有較大的差異。一般情況下，由于存在酶的消化作用，經(jīng)過培養(yǎng)后的支架其機械性能會發(fā)生明顯的降低，但低濃度支架的壓縮模量則有可能增高。這可能是由于低濃度(7%)的支架在未經(jīng)過交聯(lián)的情況下難以抵抗細胞介導(dǎo)的收縮而使原本疏松的結(jié)構(gòu)被壓實[16]。然而，Almeida等則提出了不同的結(jié)論——由于低濃度的支架細胞滲透水平較高，支架內(nèi)沉積的GAGs含量多，因此低濃度(250 mg/mL)支架經(jīng)過培養(yǎng)后的剛度會明顯高于高濃度(500 mg/mL、1 000 mg/mL)支架[18]。由此可見，材料或移植物的機械性能是由ECM濃度、孔隙結(jié)構(gòu)、以及細胞滲透程度共同決定的。

另外，與上述結(jié)論相反，Moradi等的實驗表明，ECM的濃度與支架的孔隙率及孔徑之間沒有明顯的線性關(guān)系[19]。這可能是由于不同實驗所采用的軟骨基質(zhì)顆粒大小差別較大，并且不同實驗采用的交聯(lián)方式以及設(shè)定的濃度梯度也均有不同，這些均可能導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的濃度與孔隙率之間的線性關(guān)系發(fā)生變異[16，19，27]。因此，通過改變濃度調(diào)節(jié)支架孔隙率與細胞滲透時還需要考慮多種因素的共同影響，各種因素之間的相互關(guān)系有待于進一步的實驗研究證實。

濃度對細胞滲透性能的調(diào)控是非常有限的，接種后，絕大多數(shù)細胞仍局限地沉積于支架表面[20]。 因此，有更多的研究者致力于直接改變支架的微觀結(jié)構(gòu)，為細胞滲透進入支架的中間區(qū)域提供更為直接的通道。

3 單向冷凍

凍干(freeze drying)技術(shù)在構(gòu)建組織工程支架中的應(yīng)用十分廣泛。在軟骨組織工程中，ECM微粒懸液經(jīng)過凍干后，可以獲得具有多孔結(jié)構(gòu)的固相支架。以水為液相的懸液經(jīng)過低溫處理發(fā)生冷凝過程，其內(nèi)部的晶核形成并生長，將固相物質(zhì)推開并局限于晶體結(jié)構(gòu)之間，而后，通過升華將晶體去除，余留下來的固相物質(zhì)即可構(gòu)成具有微孔結(jié)構(gòu)的支架。在這一過程中，結(jié)晶過程直接決定了獲得的固態(tài)支架的結(jié)構(gòu)[21]。冷凝過程中的成核作用是一個至關(guān)重要的步驟，它發(fā)生的位置和時間與形成的支架結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[22]。成核是一個隨機的過程，它可以在整個樣本體積中廣泛發(fā)生，也可以通過誘導(dǎo)而使其發(fā)生于樣本的特定區(qū)域，從而形成具有各向異性的晶體結(jié)構(gòu)[23]。因此，通過調(diào)節(jié)冷凍過程中的各種參數(shù)，可以影響成核與結(jié)晶的過程，從而調(diào)控支架孔隙的尺寸、分布，并構(gòu)建線性排列、甚至輪狀排列的取向性孔結(jié)構(gòu)[24-26]。

制備具有取向性結(jié)構(gòu)的支架一方面可以為再植細胞提供直接有效的滲透途徑；另一方面，也能夠在一定程度上模擬天然軟骨組織所具有的取向性微觀結(jié)構(gòu)，彌補經(jīng)過研磨或勻漿后的軟骨基質(zhì)在構(gòu)建支架時的結(jié)構(gòu)與機械性能的喪失[15]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過單向冷凍(unidirectional freezing)的方法構(gòu)建具有線性孔隙結(jié)構(gòu)支架，已是一項較為成熟的技術(shù)[28-29]。它是指通過在懸液中構(gòu)建溫度梯度，使液體分子沿溫度梯度而排列成具有方向性的結(jié)晶。這種方法基于控制溶液在預(yù)凍過程中冰晶的生長方向這樣一個簡單的技術(shù)而完成，制備過程簡單，不需加入額外的化學(xué)物質(zhì)，避免了對支架的生物相容性產(chǎn)生影響[27]。

在將單向冷凍技術(shù)應(yīng)用于軟骨脫細胞基質(zhì)的實驗研究中，構(gòu)建溫度梯度的方法有多種，其不同的參數(shù)設(shè)置也直接影響了獲得支架的結(jié)構(gòu)。在一些研究中，樣品被置于厚壁的圓柱體模具中，上端敞開與室溫平衡，下端利用低溫金屬板，形成由上至下逐漸降溫的一維溫度梯度場[21]。這種方法形成的支架孔隙能夠形成定向排列的通道，然而其孔徑與孔隙率與非定向結(jié)構(gòu)支架無明顯差異。Rowland[16]等則采用了非金屬材料，在兩種材料——聚甲醛樹脂模具與硅膠蓋之間形成溫度梯度，硅膠的(9 mm)厚度薄于聚甲醛樹脂(25 mm)，加之兩種材料本身性質(zhì)也有差異，使得兩種材料在低溫環(huán)境下的冷卻速率不同，從而形成溫度梯度，使成核作用首先開始于硅膠的內(nèi)表面。與前述結(jié)果不同的是，這種方法所形成的孔徑與孔隙率均大于其對照組的非定向均勻支架。這種差異可能來自于模具冷凍速率的不同，絕緣材料與金屬材料相比熱傳導(dǎo)速率更為緩慢，較易形成更大的孔隙[30-32]。除模具的自身性質(zhì)外，模具的表面形態(tài)也可以影響支架結(jié)構(gòu)。Rowland 等對模具表面進行了刻畫，在硅膠內(nèi)表面(成核部位)刻畫出間距為90 mm，寬度為50 mm的嵴狀突起-凹狀溝槽結(jié)構(gòu)，這種具有方向性的圖案可以誘導(dǎo)晶核形成時沿溝槽結(jié)構(gòu)排列，使軟骨基質(zhì)形成垂直于模具表面(成核表面)的層狀結(jié)構(gòu)，使支架形成二維的定向結(jié)構(gòu)。同時，表面刻畫還可以避免在單向冷凍過程中成核表面形成一部分無線性孔隙排列的致密區(qū)[16，21]。

細胞的滲透性能是由支架的孔徑大小決定的，然而，大量實驗研究表明，定向排列的孔隙可以促進細胞的滲透[33]，這使得在一定的情況下，即使定向孔結(jié)構(gòu)的孔徑小于均勻孔結(jié)構(gòu)時，仍可以表現(xiàn)出較好的細胞滲透性能[16]。植入細胞后，定向支架的孔結(jié)構(gòu)具有更好的連通性，細胞更容易向深層增殖和遷移，并表現(xiàn)出了沿著線性孔隙分布與分泌基質(zhì)的特性。具有足夠孔徑尺寸的定向孔支架與非定向孔支架，經(jīng)過較長時間的細胞培養(yǎng)，均能表現(xiàn)出較均勻的細胞分布，然而這依然不能否定定向結(jié)構(gòu)中的細胞早期快速黏附的重要性。在體內(nèi)實驗中，將再生軟骨移植于骨軟骨缺損處，支架的定向孔結(jié)構(gòu)能夠促進來自軟骨下骨的軟骨祖細胞的早期黏附，有助于移植物在關(guān)節(jié)部位的嚴苛的機械環(huán)境下保持穩(wěn)固[16]。

在大部分實驗研究中，定向孔結(jié)構(gòu)能夠增強支架的機械性能，在其取向方向上的壓縮與拉伸模量均高于均勻孔結(jié)構(gòu)支架[27，33-34]。然而通過刻畫成核表面而形成的具有層狀結(jié)構(gòu)支架，機械性能會相對減弱[16]，而減小層狀支架中的層間距離，可以使支架的壓縮模量成倍增加[35]。因此，在層狀結(jié)構(gòu)的支架中，控制孔隙的尺寸對支架的機械性能起著至關(guān)重要的作用。有實驗表明，經(jīng)過較長時間的細胞培養(yǎng)后，軟骨基質(zhì)大量沉積形成新生軟骨。此時，定向結(jié)構(gòu)支架在機械性能方面存在明顯優(yōu)勢，且移植物的機械性能呈現(xiàn)出隨著培養(yǎng)時間的延長而增高的趨勢[11，36]。然而，由于此時與機械性能相關(guān)的影響因素較多，例如，細胞的種類與密度，細胞的滲透程度，支架材料本身的強度，支架材料的濃度和交聯(lián)方式，以及細胞與支架材料的之間的相互作用等，因此通過支架結(jié)構(gòu)調(diào)控新生軟骨機械性能的方式、以及結(jié)構(gòu)因素與其他因素之間的關(guān)系還有待于進一步的研究探討。

4 孔道

在組織工程支架中制造孔道結(jié)構(gòu)，是一種人為構(gòu)建細胞擴散路徑的方法。在軟骨基質(zhì)支架中用針頭直接穿刺形成孔道(channels)，可以簡單便捷地改變支架的宏觀物理結(jié)構(gòu)，不僅可以應(yīng)用于凍干法獲得的支架中，在不經(jīng)過研磨或勻漿的脫細胞軟骨組織中也可以形成一定的細胞滲透路徑。孔道結(jié)構(gòu)對脫細胞的效果、支架的成分、微觀結(jié)構(gòu)均沒有明顯影響。另外，孔道結(jié)構(gòu)的引入在增加支架孔隙率的同時不會影響支架的壓縮模量。[15]

片狀軟骨脫細胞支架中的孔道結(jié)構(gòu)能夠促進細胞沿著孔道向支架內(nèi)部發(fā)生明顯的遷移，細胞分泌的基質(zhì)也同時沉積在支架表面與孔道內(nèi)部。值得注意的是，這種孔道結(jié)構(gòu)的直徑較寬，在支架中的孔道底部可見部分細胞死亡，這可能是由于孔道內(nèi)大量的細胞聚集沉積，營養(yǎng)運輸不暢所致。針對這一現(xiàn)象，可以通過生物反應(yīng)器進行動態(tài)培養(yǎng)，增強營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物在孔道內(nèi)的運輸，并為細胞提供了一定的生物物理刺激。這種培養(yǎng)方式明顯提高了孔道內(nèi)的細胞存活率，使細胞在孔道內(nèi)均勻分布，并且增強了細胞分泌胞外基質(zhì)的能力。然而與靜態(tài)培養(yǎng)相比，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的細胞增殖程度有所降低，這種現(xiàn)象的原因可能來自旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)對細胞產(chǎn)生的剪切力影響了細胞黏附[15]。

5 激光微刻

孔道結(jié)構(gòu)可以促進細胞向支架內(nèi)部分布，但仍不能使細胞均勻地分布于ECM內(nèi)。因此，為了提高細胞滲透性，完善支架性能，激光微刻技術(shù)(laser micropatterning, LMP)被引入軟骨脫細胞基質(zhì)，構(gòu)建更均勻的支架微觀孔道結(jié)構(gòu)。

激光微刻是通過激光消融技術(shù)改變材料的物理結(jié)構(gòu)以及表面性能的方法。激光照射生物組織時,對組織加熱并產(chǎn)生熱損傷，同時還可能發(fā)生組織汽化、熔融、噴射和高溫分解等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象導(dǎo)致生物組織被去除作用，稱為“組織消融”(tissue ablation)[38]。CO2激光是一種普遍被用于消融生物材料的激光，波長是10.64 μm，其最小波束寬度為80 μm,這決定了其所形成的孔道直徑落在了細胞黏附與增殖的最適直徑范圍內(nèi)[39-40]。另外，根據(jù)需要形成的孔道直徑還可以通過激光參數(shù)進行調(diào)節(jié)[41-42]。軟骨基質(zhì)經(jīng)過激光消融前首先進行凍干處理，可以優(yōu)化激光微刻的效果，避免組織內(nèi)的水分使激光發(fā)生衍射。

激光微刻形成的孔道密度、直徑、連通性是確定可控的，因此，對支架機械性能、細胞滲透，以及細胞的增殖分化與代謝活性的影響也一定程度可控。經(jīng)過脫細胞處理的生物支架機械性能會發(fā)生明顯下降[15]，而經(jīng)過脫細胞、凍干、激光微刻、再水化的一系列處理后，所獲得的生物支架與天然軟骨之間有相似的機械壓力-應(yīng)變曲線，表明其具有與天然軟骨相似的機械性能，其中，一定密度的激光微刻孔道結(jié)構(gòu)對支架的壓縮模量沒有明顯影響[43]。細胞可以通過貫穿于支架全層存在的激光微刻孔道，短時間內(nèi)即可滲透與定植于支架內(nèi)部。隨著細胞培養(yǎng)的時間增加，表層細胞逐漸向支架內(nèi)層遷移分布，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，在具有120 μm的孔道直徑、厚度約為2 mm的支架中可以形成基本均勻的細胞分布[43]。

激光微刻支架能夠進一步增強細胞定植早期的代謝活性，并在細胞黏附、穩(wěn)定及增殖的過程中，提供更大的細胞與支架間的接觸面積，以及營養(yǎng)運輸渠道，使培養(yǎng)過程中的細胞密度也明顯高于非激光微刻支架。生物材料支架經(jīng)過細胞培養(yǎng)后，由于細胞分泌消化酶的作用會導(dǎo)致材料初期的機械性能下降，而細胞外基質(zhì)的不斷分泌與沉積則會增強材料的機械性能。無孔道支架由于細胞大部分被限制于支架表層，沒有表現(xiàn)出明顯的機械性能的上升。而激光微刻支架由于孔道的存在，使細胞在支架內(nèi)能夠更均勻地分泌基質(zhì)，從而使支架的機械性能在下降前就出現(xiàn)了顯著的提高，并始終高于非激光微刻支架。因此，LMP支架的特殊結(jié)構(gòu)使軟骨脫細胞外基質(zhì)支架性能獲得了顯著的提升[38-40，43]。

在組織工程支架中通過各種方法引入孔結(jié)構(gòu)，具有相似的增強細胞滲透性和機械性能的效果，而孔隙的參數(shù)不同(例如直徑、密度、高度)也對細胞的生物學(xué)行為以及支架的力學(xué)性能產(chǎn)生一定影響。除一維方向上的孔隙結(jié)構(gòu)，更復(fù)雜、與天然軟骨更相似的組織工程支架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建也有待于進一步的探索研究。

6 總結(jié)

軟骨組織的組織結(jié)構(gòu)致密、缺乏血管且細胞成分少，關(guān)節(jié)區(qū)的軟骨還需要承擔(dān)較大的生物力學(xué)負載。由于軟骨組織的特殊性能，一些應(yīng)用于其他組織類型的提高脫細胞基質(zhì)支架孔隙率的方法在軟骨組織中并不適用。例如，超聲處理能夠清除微小膠原纖維，提高動脈組織脫細胞支架孔隙率[44]，但在軟骨中的應(yīng)用則沒有明顯效果[15]。

軟骨的組織特性決定了軟骨組織工程支架具有特殊的要求。脫細胞基質(zhì)支架作為一種成分與結(jié)構(gòu)均與天然組織最為相似的天然生物材料，在軟骨組織中的應(yīng)用尚存在一定的缺陷，尚待研究，主要表現(xiàn)在：脫細胞方案與效果評價尚未形成統(tǒng)一標準，同種異體移植物的組織來源或異基因移植物的免疫學(xué)機制，模擬天然軟骨組織的組織成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞分布，構(gòu)建符合一定生理需要并能持續(xù)維持的機械性能。其中，支架微觀孔隙結(jié)構(gòu)的構(gòu)建對新生組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞在支架中的滲透與分布，以及支架機械性能的構(gòu)建起到了重要的作用。因此，對支架微觀孔隙結(jié)構(gòu)的探索在未來的研究中不可或缺，從而使得支架的性能得到進一步的完善，使ECM生物支架在組織工程和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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