何淑鳳

無錫市婦幼保健院計劃生育科，江蘇 無錫 214000

稽留流產(chǎn)致病因素復(fù)雜，臨床發(fā)現(xiàn)，既往有稽留流產(chǎn)史，再發(fā)稽留流產(chǎn)風(fēng)險增高，反復(fù)妊娠失敗給患者及家庭造成不良影響，因此尋找稽留流產(chǎn)確切病因成為重中之重，目前已知導(dǎo)致胚胎早期流產(chǎn)的主要原因是染色體異常，占比達50%～60%[1]。對于1次妊娠失敗，患者急切希望了解此次妊娠失敗的原因，通常先采用染色體核型分析技術(shù)明確是否染色體異常導(dǎo)致，但由于稽留流產(chǎn)，妊娠組織在宮腔內(nèi)滯留時間長、胚胎壞死、機化，用于細胞培養(yǎng)的新鮮絨毛少之又少，加上細胞培養(yǎng)周期長、標本污染、清宮過程中混有母源組織影響等因素，培養(yǎng)失敗率高，因此傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)在稽留流產(chǎn)的病因診斷中有一定的局限性，它通常應(yīng)運于產(chǎn)前診斷，來避免染色體異常患兒出生[2]。而熒光原位雜交技術(shù)（FISH）采用特有探針，檢測過程中只要求靶細胞的細胞核完整，對樣本要求低，而且不用擔(dān)心標本污染、操作簡單、方便快捷、敏感度高、特異性強，一定程度上提高了檢測的效率和成功率[3]，目前在臨床上應(yīng)用增多[4]。但由于探針特異性，不能完全覆蓋23對染色體，亦存在漏診，有文獻報道FISH的漏檢率高達39.3%[5]，因此臨床運用亦存在局限性。本研究通過收集78例胚胎停育患者妊娠組織，進行染色體核型分析及FISH檢測，以期為胚胎停育患者查找原因找出更切合實際的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月～2016年7月于本院計劃生育病區(qū)住院的胚胎停育患者78例，B超檢查明確胚胎停育，年齡23～44歲（29.26±4.72歲），停經(jīng)時間75.31±11.40 d，孕次1.33±1.43次，胚胎停育次數(shù)0.59±0.76次，患者要求清宮術(shù)后對本次妊娠組織行細胞遺傳學(xué)檢測，簽署同意書，在無菌條件下行清宮術(shù)，取出妊娠組織置于無菌生理鹽水中固定，并立即送實驗室。78例胚胎停育孕婦的妊娠組織中，38例培養(yǎng)成功，采用染色體核型分析，40例培養(yǎng)失敗采用FISH檢測。兩組孕婦年齡、孕周及孕次差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。組間具有可比性。

表1 兩組孕婦年齡、孕周及孕次比較 （Mean±SD）

1.2 方法

1.2.1 絨毛染色體培養(yǎng) 清宮術(shù)中取無菌妊娠組織物，肉眼選取絨毛組織，常規(guī)處理，細胞培養(yǎng)5～15 d，整個培養(yǎng)過程嚴格無菌。常規(guī)消化法收獲細胞、制片、G顯帶。光鏡下計數(shù)20個中期分裂相，分析3～5個染色體核型。按照《人類細胞遺傳學(xué)命名國際體制（ISCN）》（2009）進行染色體核型命名。

1.2.2 FISH檢測 臨床上已有成熟的熒光DNA探針試劑盒（但探針僅有7種：13、16、18、21、22、X、Y染色體），按試劑盒說明操作，經(jīng)變性、雜交、洗片、復(fù)染后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。正常染色體信號顏色：13/22均為2綠色；16/21均為2紅色；18、X、Y染色體信號顏色分別為藍色、綠色、紅色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨毛染色體核型分析及FISH檢測結(jié)果

妊娠組織成功用于染色體核型分析者38例，其中檢出正常核型23例，占60.53%（23/38），異常核型15例，占39.5%（15/38），異常核型中以染色體數(shù)目異常為主，常染色體三體占53.3%（8/15），三倍體1例，占6.67%（1/15），性染色體異常3例，占20%（3/15），結(jié)構(gòu)異常3例，占20%（3/15）。40例染色體培養(yǎng)失敗，采取FISH檢測，全部檢出，正常染色體15例，占37.5%（15/40），異常染色體25例，占62.5%（25/40），其中常染色體三體19例，占76.0%（19/25），三倍體2例，占8%（2/25），45XO 4例，占16%（4/25）（表2）。

2.2 胚胎停育患者年齡與染色體之間的關(guān)系

本研究中胚胎停育孕婦年齡≥35歲者12例，異常染色體占比83.33%（10/12），高于年齡＜35歲胚胎停育孕婦的異常染色體占比45.46%（30/66），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表2 38例絨毛染色體異常核型及40例絨毛細胞異常FISH檢測結(jié)果

表3 胚胎停育患者年齡與染色體之間的關(guān)系

3 討論

胚胎停育是一種病因復(fù)雜的疾病，臨床上反復(fù)胚胎停育患者居多，有逐漸上升趨勢，多次不良妊娠結(jié)局及清宮手術(shù)不僅給孕婦身體造成嚴重影響，如宮腔粘連，需進行多次手術(shù)分離粘連，而且迫于家庭及社會壓力，孕婦極易有焦慮、挫敗感、抑郁癥等情緒。有研究評估了156例不良孕產(chǎn)史患者的心理狀況，結(jié)果顯示近一半存在焦慮情緒，其中以高齡及高學(xué)歷為主[6]。高學(xué)歷大多伴隨高齡，研究結(jié)果亦證實高齡是唯一能夠被證實的與染色體異常有關(guān)的因素[7]。本文對≥35歲及＜35歲異常染色體的對比研究中，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于隨母體年齡增加，卵細胞老化從而導(dǎo)致卵細胞異常，最終導(dǎo)致染色體在減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)了不分離。研究指出女性年齡本身不可能誘發(fā)卵母細胞減數(shù)分裂I期的同源染色體分離異常，而是由于隨著年齡增加，卵母細胞內(nèi)保障染色體精確分離的分子或者細胞學(xué)基礎(chǔ)可能發(fā)生變化而導(dǎo)致染色體不能正確分離，進而引起染色體異常[8]?；袅鳟a(chǎn)由于其致病因素復(fù)雜，涉及因素眾多，又相互關(guān)聯(lián)，因此探究引起胚胎停育的原因時常采取排除法，若胚胎染色體正常，向其他方向查找原因。如若染色體異常，則考慮由于染色體異常導(dǎo)致的胚胎停育可能性大。染色體異常中，以數(shù)目異常最為多見。數(shù)目異常中，又以常染色體三體多見，約占50%～52%[9]。本研究78例稽留流產(chǎn)標本組織，采用常規(guī)的細胞培養(yǎng)+染色體核型分析，僅38例成功培養(yǎng)并分析，其中檢出異常核型15例，異常核型中以染色體數(shù)目異常為主，常染色體三體占53.3%。40例染色體培養(yǎng)失敗，采取FISH檢測，全部檢測成功，異常染色體25例，其中常染色體三體19例?？紤]引起胚胎停育的主要原因是胚胎染色體異常，由于異常染色體所攜帶的基因失衡，從而阻止了其正常發(fā)育進程，在孕早期以稽留流產(chǎn)、自然流產(chǎn)、死胎等形式自然淘汰。也有少數(shù)染色體異常胚胎可以存活至出生，但或多或少合并臟器畸形或智力缺陷。

本文染色體核型分析及FISH檢出數(shù)目異常率分別為39.5%、62.5%，均低于文獻報道率，兩種檢測方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因FISH檢測技術(shù)對標本要求低，使得檢測成功率方面較傳統(tǒng)染染色體核型分析技術(shù)更勝一籌。臨床常見的常染色體數(shù)目異常有9、13、14、15、16、18、21和22三體。其中16三體占比高達20%～30%[10]，本文通過染色體核型分析及FISH檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)16三體占比分別為2.63%、7.5%，可能與樣本量少有關(guān)，后續(xù)需積累并增加樣本量，進一步研究。想要了解胚胎停育患者是否由于染色體異常導(dǎo)致妊娠丟失，目前臨床上通常采用胚胎絨毛染色體核型分析技術(shù)及熒光原位雜交技術(shù)，這兩項檢測技術(shù)各有其優(yōu)缺點，染色體核型分析較為傳統(tǒng)，它是遺傳學(xué)檢驗的基礎(chǔ)，可以對整個染色體組進行數(shù)目及結(jié)構(gòu)上的分析，但難以發(fā)現(xiàn)小片段的染色體重排。培養(yǎng)過程中，對樣本要求高，要求樣本嚴格無菌、新鮮，有存活細胞，但由于胚胎停育患者絨毛組織宮腔內(nèi)滯留時間長、通常絨毛陳舊變性、壞死，血凝塊夾雜雜質(zhì)較多，且細胞活力差，宮內(nèi)及手術(shù)操作、培養(yǎng)過程中的細菌污染，容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，有報道細胞培養(yǎng)失敗率為5%～42%[11]，概率區(qū)間較大，可能與各實驗室檢驗人員技術(shù)及實驗室條件不同有關(guān)。絨毛細胞培養(yǎng)需要7～14 d[12]，單個樣本細胞培養(yǎng)+染色體核型分析診斷時間約為30 d[13]，即使存在各種制約條件，但目前臨床上使用最多最基本的遺傳學(xué)檢查仍是染色體核型分析，對于染色體結(jié)構(gòu)異常、低比例嵌合體仍有不可替代的優(yōu)勢。FISH檢測是利用熒光標記的特定的DNA探針與靶細胞DNA片段雜交，用特殊的熒光顯微鏡觀察雜交信號，從而對待測核酸進行定性、定位及定量分析[3]。它操作簡單，無需標本無菌，不僅能檢測出染色體結(jié)構(gòu)異常，亦能判斷出染色體嵌合現(xiàn)象[14]。但因特異性探針的制約，臨床只能檢測到常見的7對染色體的數(shù)目異常，如常見的21三體、18三體、13三體及性染色體異常，然而人類胚胎非整倍體異常的發(fā)生幾乎覆蓋所有染色體；單個FISH探針難以檢測出染色體局部不平衡；不能辨別母細胞污染的女性胎兒標本；并且還存在一定的假陰性與假陽性[15]。因雜交失敗或非特異雜交、雜交信號重疊或距離過近導(dǎo)致錯誤判讀等缺點[16]，因此臨床應(yīng)用具有一定的局限性。目前臨床上沒有絕對好的檢測方法，只有依據(jù)病情及實際情況，在傳統(tǒng)遺傳學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他先進的檢測方法才是最適合的。特別對多次胚胎停育及迫切需要孕育正常小孩的患者，建議行輔助生殖技術(shù)助孕，對胚胎進行植入前診斷，從源頭上發(fā)現(xiàn)并解決問題，以期增加正常妊娠機會。目前，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，臨床上常見的胚胎植入前遺傳學(xué)篩查技術(shù)手段繁多，如比較基因組雜交(array-CGH)、單核苷酸多態(tài)性陣列、多元定量PCR和下一代測序。有研究證實了PGS可增加胚胎植入及臨床受孕率，降低流產(chǎn)率等[17]。但PGS需要侵入性胚胎活組織檢查，有文章已證實侵入性取材，可降低胚胎質(zhì)量[18]。甚至有動物研究顯示，在子代神經(jīng)和腎上腺發(fā)育方面亦存在不良影響[19]。FISH技術(shù)作為最初的植入前診斷技術(shù)，因?qū)ε咛ビ袆?chuàng)，而且對改善臨床結(jié)局無益[20]，目前被擱淺。近期發(fā)展起來的無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)通過提取培養(yǎng)液中游離的極微量的DNA，采用單細胞全基因組擴增技術(shù)實現(xiàn)對胚胎染色體的全面篩查，從而選擇染色體正常的胚胎進行移植[21]，減少不良妊娠，作為一種新技術(shù)被寄予厚望。

[1]樂 杰. 婦產(chǎn)科學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004: 89-92.

[2]郭芬芬, 徐 盈, 陳必良, 等. 934例絨毛染色體核型分析[J]. 中國產(chǎn)前診斷雜志電子版, 2016, 8(1): 23-6.

[3]吳偉晴, 吳 炎, 鐘曉茹, 等. 熒光原位雜交技術(shù)檢測145例胚胎停育患者絨毛染色體異常分析[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2016,24(3): 40-1.

[4]雷 瓊, 王 瓊, 周燦權(quán). 不同分子遺傳學(xué)方法用于自然流產(chǎn)絨毛細胞遺傳分析的效果[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2009, 44(4): 253-6.

[5]呂杰忠, 杜 濤, 張嘉寧, 等. 熒光原位雜交和染色體核型分析診斷自然流產(chǎn)胚胎染色體畸變的對比研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2014, 31(6): 803-4.

[6]呂 巍, 曹欣冬, 周 衡. 不良孕產(chǎn)史患者焦慮狀態(tài)研究[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2013, 3(45): 752-5.

[7]Pacchierotti F, Adler ID, Eichenlaub-Ritter U, et al. Gender effects on the incidence of aneuploidy in mammalian germ cells[J].Environ Res, 2007, 104(1): 46-69.

[8]史慶華, 張堅宣, 潘淑娟, 等. 用GT重復(fù)多態(tài)性診斷21三體患者中超數(shù)21號染色體減數(shù)分裂起源的研究[J]. 遺傳學(xué)報, 1998, 25(6):478-84.

[9]馬玲利, 叢 林, 袁 靜, 等. 100例早孕胚胎停育絨毛染色體核型分析[J]. 中國婦幼保健, 2011, 26(26): 4104-5.

[10]雷彩霞, 張月萍. 1437例早孕期自然流產(chǎn)胚胎核型分析[J]. 生殖與避孕, 2014, 34(4): 328-31.

[11]楊 鍇, 祝建疆, 戚 紅, 等. 1389例稽留流產(chǎn)絨毛細胞染色體核型分析[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2014, 22(7): 53-4.

[12]常 亮, 張秋芳, 李 丹, 等. 熒光原位雜交與染色體核型分析應(yīng)用于自然流產(chǎn)病因?qū)W診斷的比較研究[J]. 生殖與避孕, 2013,33(2): 73-7.

[13]Lathi RB, Loring M, Massie JA, et al. Informatics enhanced SNP microarray analysis of 30 miscarriage samples compared to routine cytogenetics[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e31282-4.

[14]Papavassiliou P, York TP, Gursoy N, et al. The phenotype of persons having mosaicism for trisomy 21/Down syndrome reflects the percentage of trisomic cells present in different tissues[J]. Am J Med Genet A, 2009, 149A(4): 573-83.

[15]Mann K, Donaghue C, Fox SP, et al. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy[J]. Eur J Hum Genet, 2004, 12(11): 907-15.

[16]華 芮, 全 松. 植入前遺傳學(xué)篩查技術(shù)爭議與重新認識[J]. 中國實用婦科與產(chǎn)科雜志, 2016, 32(3): 240-5.

[17]Scott RT, Jr. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial[J]. Fertil Steril, 2013, 100(3):697–703.

[18]Danilo C, Antonio C, Filippo MU, et al. The impact of biopsy on human embryo developmental potential during preimplantation genetic diagnosis[J]. Biomed Res Int, 2016, 71(9): 3075-9.

[19]Wu Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice[J]. Cell Mol Life Sci,2014, 71(9):1761–74.

[20]Palini S, De Stefani S, Primiterra MA. Pre-implantation genetic diagnosis and screening: now and the future[J]. Gynecol Endocrinol, 2015, 31(10): 755-9.

[21]Xu J, Fang R, Chen L, et al. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016,113(42): 11907-12.