梁煥坤，葉景文，李佳麗，陳翠翠，郭曉曉，劉細(xì)潘，鐘樹海，黎杰星，李來慶

廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510663

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第1位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位[1-2]。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為6.61/10萬[3-4]，列惡性腫瘤發(fā)病率的第9位。膀胱癌復(fù)發(fā)率高[5]，復(fù)發(fā)后的病例常伴有腫瘤病理分級(jí)增加、肌層浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，早期做出正確的診斷對(duì)疾病的治療與預(yù)后有重要的臨床意義。目前臨床上面測定癌胚抗原（CEA）和核基質(zhì)蛋白22（NMP22）的方法，都是采用單標(biāo)記方法，即1次檢測只能得到1種標(biāo)志物的含量，通量較小。本研究以雙抗夾心法，建立同時(shí)檢測CEA和NMP22的雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫熒光分析（TRFIA）法，為膀胱癌快速準(zhǔn)確檢測提供新的理念和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CEA和NMP22單克隆抗體自制；Eu3+標(biāo)記試劑盒購自PerkinElmer；BSA來源于Fitzgerald；Sephades-G50填料購自GE；96孔板購自Costar；CEA測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自北京熱景生物公司；包被緩沖液、洗滌液、封閉液、增強(qiáng)液均為自制。DR-6606時(shí)間分辨熒光分析儀購自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司。88份膀胱癌陽性尿液樣品和60份膀胱癌陰性血液樣品均由濟(jì)南軍區(qū)第88醫(yī)院提供。

1.2 固相包被抗體的制備

用50 mmol/L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將CEABSA和NMP22-BSA的包被原稀釋成2 μg/mL，100 μL/孔同時(shí)加入到96孔板中，4 ℃過夜，棄包被液，加入封閉液，37 ℃封閉2 h，棄掉封閉液，洗滌，真空抽干冷凍并于–20 ℃保存

1.3 Eu3+和Sm3+標(biāo)記抗體

將0.5 mg標(biāo)記抗體加入Millipore的帶有濾膜的離心管中，8000 r/min離心8 min。再用標(biāo)記緩沖液（50 mmol/L，Na2CO3，pH 9.0）重復(fù)洗滌6次。將200 μL標(biāo)記抗體和50 μg銪（或釤）標(biāo)記試劑充分混勻，25 ℃振蕩過夜。

1.4 Eu3+和Sm3+標(biāo)記抗體的純化

標(biāo)記完成后用Sephadex G-50層析柱分離純化，洗脫液（含0.9% NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl）洗脫，同時(shí)收集流出液（1 mL/管），逐管測量吸光度（A280），測定蛋白含量，根據(jù)Eu3+和Sm3+標(biāo)記試劑盒說明書所提供的公式測定標(biāo)記率和蛋白回收率。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用含0.2%BSA，0.1%NaN3，50 mmol/L的pH 7.8 Tris-HCl緩沖液，將CEA蛋白稀釋成0、1、5、25、50、250、500、600 ng/mL系列參考標(biāo)準(zhǔn)溶液；將NMP22蛋白稀釋成0、1、10、50、100、500、1000 U/mL系列參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，每瓶1 mL分裝，–20 ℃保存?zhèn)溆?。檢測CEA和NMP22的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型（Log-Logit）擬合。

1.6 分析操作程序

向包被酶聯(lián)板上加入25 μL CEA/NMP22參考標(biāo)準(zhǔn)品或待測血清，再加入200 μL分析緩沖液，震蕩溫育1 h，洗滌液洗滌4次，再加入以分析緩沖液1:50～1:100倍稀釋的Eu3+-CEA單克隆抗體與Sm3+-NMP22單克隆抗體的混合物200 μL/孔，震蕩溫育1 h，洗滌液洗滌6次，最后加入增強(qiáng)液200 μL/孔震蕩5 min后在時(shí)間分辨熒光檢測儀上進(jìn)行檢測。

1.7 TRFIA法性能檢測

（1）稀釋回收率：從收集的88份膀胱癌陽性患者尿液樣品中隨機(jī)抽取3份尿液樣本，其CEA的濃度分別為：24、58、73 ng/mL，取另3個(gè)患者的尿液，其NMP22的濃度分別為：26、99、133 U/mL，稀釋濃度均為1:20、1:40、1:80倍比稀釋，每個(gè)樣本重復(fù)3次，重復(fù)檢測3次，比較樣本的測定值、真值及其比值。（2）線性范圍：CEA抗原和NMP22作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度進(jìn)行測定，CEA濃度為0、1、5、25、50、250、500、600、800、1600 ng/mL，NMP22濃度為0、1、10、50、100、500、1000、1250、5000 U/mL，每個(gè)濃度測定3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)測定3次，進(jìn)行劑量線性回歸分析和計(jì)算試驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)。（3）靈敏度：以零參考標(biāo)準(zhǔn)品（CEA和NMP22抗原）當(dāng)做樣本，將測定20次的熒光值均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出最低檢測量。（4）精密度：將自制的質(zhì)控品（CEA和NMP22抗原）稀釋至高、中、低3個(gè)濃度，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔重復(fù)檢測10次，計(jì)算各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)（CV）值。（5）穩(wěn)定性：自制的試劑盒置于4 ℃冰箱6月和37 ℃ 7 d，對(duì)試劑盒的物理外觀，劑量-反應(yīng)曲線的線性、準(zhǔn)確度、靈敏度、最低檢測量等指標(biāo)進(jìn)行測定，具體檢測方法同上步驟（1）和（4）。（6）與其他膀胱癌檢測方法比較：用自行制備的CEA和NMP22雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光檢測試劑盒與人CEA ELISA檢測試劑盒、病理學(xué)同時(shí)檢測已用膀胱尿道鏡檢確定的88例膀胱癌尿液樣本和60份膀胱癌陰性尿液樣本，對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記物的標(biāo)記率和回收率

Eu3+和Sm3+標(biāo)記物的標(biāo)記率分別為9.53/抗體、9.25/抗體，蛋白回收率為分別89.4%、91.10%。

2.2 雙標(biāo)記CEA/NMP22標(biāo)準(zhǔn)曲線

CEA和NMP22標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)分別為：CEA：y=0.9847x+4.0943，R2=0.9995； NMP22：y=1.0198x+3.9834，R2=0.9994，表明線性相關(guān)性良好，其劑量-反應(yīng)曲線如圖1所示，表明本試劑盒有良好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。

2.3 稀釋回收率

CEA的回收率在95.89%～100.64%之間；NMP22的回收率在97.74%～103.3%之間。

2.4 線性范圍和靈敏度

CEA蛋白當(dāng)濃度低于600 ng/mL時(shí)，熒光值呈線性升高（R2=0.9995，圖2A）；濃度高于600 ng/mL時(shí)，熒光值不再呈線性升高，曲線呈緩慢上升（圖2B），故CEA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0～600 ng/mL。NMP22蛋白當(dāng)濃度低于1000 ng/mL時(shí)，熒光值呈線性升高（R2=0.9994, 圖2C）；濃度高于1000 ng/mL時(shí)，熒光值不再呈線性升高，曲線呈緩慢上升（圖2D），故NMP22蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0～1000 ng/mL。以零參考標(biāo)準(zhǔn)品測定20次的熒光值均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得出試劑盒檢測CEA的靈敏度為 0.12 ng/mL，NMP22的檢測靈敏度為0.21 U/mL。

2.5 精密度

用自制的CEA/NMP22的TRFIA試劑盒分析，批內(nèi)CV＜5%，批間CV＜10%（表2）。

圖1 雙標(biāo)記CEA/NMP22標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 自制CEA/NMP22 TRFIA試劑盒回收率評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 試劑盒線性范圍測試結(jié)果圖

表2 自制CEA/NMP22的TRFIA試劑盒分析

2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，自制的試劑盒置于4 ℃冰箱能穩(wěn)定6月以上，37 ℃熱破壞性試驗(yàn)?zāi)艹掷m(xù)7 d以上。

2.7 與膀胱癌其他診斷方法比較

自行制備的CEA/NMP22 TRFIA檢測試劑盒與CEA ELISA檢測試劑盒、病理學(xué)的檢測結(jié)果比較見表3～4。TRFIA試劑盒與膀胱尿道鏡檢方法比較，陽性率符合率為97.7%，陰性符合率為100%。

表3 幾種方法檢測膀胱癌尿液樣本的符合率（n=88）

表4 幾種方法檢測膀胱癌陰性尿液樣本的符合率（n=60）

3 討論

膀胱腫瘤標(biāo)記物作為一種新興的膀胱癌診斷指標(biāo)，是膀胱癌早期診斷、指導(dǎo)治療及評(píng)估預(yù)后的有效手段[7-15]。CEA最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌及胎兒腸組織中，正常尿路上皮不存在癌胚抗原，但膀胱癌患者的血漿和尿中CEA卻明顯上升。連續(xù)監(jiān)測膀胱癌患者尿液中CEA水平可用于腫瘤治療的療效觀察及預(yù)后判斷[16-17]，對(duì)已確診的腫瘤病人的預(yù)后與評(píng)價(jià)治療效果有重要意義。

NMP22即細(xì)胞核有絲分裂器蛋白是核基質(zhì)蛋白家族中的一種，于1980年首次發(fā)現(xiàn)并命名，在膀胱癌上皮細(xì)胞內(nèi)的含量要比正常尿路上皮高數(shù)十倍。NMP22在細(xì)胞死亡后被釋放到尿液中，以可溶性復(fù)合物或片段的形式存在于人的尿液中，與尿路上皮腫瘤密切相關(guān)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可以檢測其濃度[18]，這是NMP22作為臨床診斷膀胱移行細(xì)胞癌的依據(jù)。公開資料表明：NMP22檢測膀胱癌的總敏感性為73.2%～100%，特異性為85%～97%。更詳細(xì)的分析表明：NMP22診斷Ta和T1期的膀胱癌敏感性為71%，特異性為93.8%；而在T2-4期的腫瘤，其敏感度可顯著提高到92.6%，特異性93.8%[19]。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)NMP22用于膀胱癌的檢測，在檢測膀胱癌的臨床研究中顯示了較高的性能。

TRFIA是一種新型的體外超微量分析定量技術(shù)。它采用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物代替熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞，待反應(yīng)體系（如：抗原抗體反應(yīng)、核酸探針雜交、生物素親和素反應(yīng)以及靶細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等）發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到定量分析。它克服了酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定、化學(xué)發(fā)光僅能1次發(fā)光且易受環(huán)境干擾、電化學(xué)發(fā)光的非直接標(biāo)記等缺點(diǎn)，使非特異性信號(hào)降低到可以忽略的程度，達(dá)到了極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達(dá)到的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡便、儲(chǔ)存時(shí)間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)，成為90年代后非放射性免疫分析發(fā)展的新里程碑，正逐步推廣到瘤標(biāo)監(jiān)測中[20]。

基于此，本研究團(tuán)隊(duì)擬利用銪（Eu3+）標(biāo)記抗CEA單克隆抗體和釤（Sm3+）標(biāo)記抗NMP22單克隆抗體，采用雙抗體夾心法建立CEA/NMP22雙標(biāo)記TRFIA試劑，自行研制能同時(shí)檢測人尿液CEA和NMP22的TRFIA試劑盒，本研究所研制的試劑盒測定結(jié)果顯示，試劑盒CEA的靈敏度為 0.12 ng/mL，NMP22的檢測靈敏度為0.21 U/mL。批內(nèi)CV小于5%，批間CV小于10%，達(dá)到臨床測試要求（批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜15%）；試劑盒檢測樣本濃度CEA蛋白的線性范圍為0～600 ng/mL，NMP22蛋白的線性范圍為0～1000 ng/mL，檢測范圍寬。此外，本試劑盒的靈敏度高，可同時(shí)聯(lián)合檢測CEA與NMP22兩種腫瘤標(biāo)志物，以期達(dá)到定量、快速、簡便、敏感的對(duì)膀胱癌做出早期診斷。

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