華俊豪,李 光,王義權(quán)

(廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室,福建廈門361102)

多基因表達(dá)載體的優(yōu)勢在于可同時表達(dá)2個或多個基因,但早期常用的多基因表達(dá)載體多存在容量小,易出現(xiàn)上、下游基因表達(dá)失衡,蛋白活性低或所表達(dá)蛋白不能精確定位等缺陷[1],后來研究者在2個目的基因間插入一段內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRESs),用于表達(dá)2個非偶聯(lián)的蛋白,成功克服了表達(dá)活性低及不能精確定位等問題;然而IRESs與核糖體結(jié)合的親合力不易調(diào)控,對所表達(dá)的下游蛋白活性影響較大[2],這些因素限制了這一策略在構(gòu)建多基因表達(dá)載體上的應(yīng)用．近年來,一種具有自剪切功能、由2A肽(P2A)介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體得到廣泛應(yīng)用,該策略避開了多基因表達(dá)時蛋白活性不高和下游基因表達(dá)量低等缺陷,是較為理想的多基因表達(dá)方法[3]．此方法通過P2A改變核糖體的活性,促進(jìn)P2A的甘氨酸殘基(Gly)與tRNA-Gly之間酯鏈的水解,從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上釋放上游多肽的同時又推進(jìn)下游多肽的翻譯[4];此外,在目的基因上游或下游插入信號肽編碼序列,可使所表達(dá)的目的蛋白定位到細(xì)胞核、葉綠體、線粒體、細(xì)胞膜或胞質(zhì)微管等特定位置[5]．

文昌魚(amphioxus)隸屬于脊索動物門(Chordata)頭索動物亞門(Cephalochordata),是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的一個重要過渡類群,也是現(xiàn)存脊索動物門中最古老的一個類群,在研究脊椎動物起源與演化方面有十分重要的作用[6]．文昌魚有個體小、產(chǎn)卵量大、體外受精、體外發(fā)育、胚胎及成體都透明而便于觀察等優(yōu)點,隨著實驗室人工繁育成功[7]、誘導(dǎo)產(chǎn)卵技術(shù)完善[8]和胚胎顯微注射技術(shù)建立[9]等一系列成果的取得,其作為模式動物應(yīng)用的腳步正不斷加快．然而現(xiàn)階段以文昌魚為材料的研究中,還不像其他模式動物那樣已有各種商品化的分子工具可以直接應(yīng)用,因此大大阻礙了文昌魚作為模式動物的應(yīng)用．

Kim等[10]通過pSYC-97質(zhì)粒(pCS2轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))在HeLa細(xì)胞、斑馬魚(Daniorerio)胚胎、小鼠(Musmusculus)肝細(xì)胞中驗證了P2A介導(dǎo)的eGFP和mCherry基因表達(dá),且上、下游蛋白剪切效率極高．由于pCS2轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在文昌魚中表達(dá)效率不高,為此本研究基于pXT7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX的mRNA并注入文昌魚胚胎,驗證在受精后文昌魚體內(nèi)P2A介導(dǎo)表達(dá)的eGFP和mCherry蛋白剪切效果,進(jìn)而構(gòu)建由文昌魚熱激蛋白基因啟動子(BbHsp70)啟動的P2A介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體,為文昌魚未來的轉(zhuǎn)基因研究和基因功能分析提供有效的分子工具．

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗中所用佛羅里達(dá)文昌魚(Branchiostomafloridae)引種自游智凱博士實驗室(Institute of Cellular and Organismic Biology,Taiwan,China),采用本實驗室已建立的方法[7]飼養(yǎng),按照已報道的方法[11]誘導(dǎo)產(chǎn)卵;實驗中所用引物由廈門鉑瑞生物科技有限公司合成;pSYC-97質(zhì)粒由Kim博士(Chonnam National University Medical School,Republic of Korea)提供[10];pXT7和BbHsp70-pCAG載體為本實驗室自存;Primer Star高保真DNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶KphⅠ和SpeⅠ購自TaKaRa公司;D2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購自O(shè)mega公司;Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購自TransGen公司;mMESSAGE mMACHINE T7 mRNA合成試劑盒購自Ambion公司;熒光染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自Roche公司;RIPA裂解液購自碧云天公司;anti-eGFP多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司;羊抗鼠肌動蛋白(actin)單克隆抗體購自Proteintech公司;辣根過氧化物酶-增強型化學(xué)發(fā)光法(HRP-ECL)顯色底物購自 Advansta公司．

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建與mRNA合成

以含有目的片段NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX的質(zhì)粒pSYC-97為DNA模板,按目的片段上、下游序列設(shè)計引物eGFP-P2A-mCherry-F1(5′-GGGGTACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGT-3′)和eGFP-P2A-mCherry-R1(5′-GGACTAGTTCAGGAGAGCACACACTTGCA-3′),引物設(shè)計時分別在5′-端與3′-端引入KphⅠ和SpeⅠ黏性末端酶切位點(下劃線),用Primer Star高保真DNA聚合酶擴增目的片段．PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接到pXT7載體上,轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR篩選陽性克隆,測序驗證,獲得重組的eGFP-P2A-mCherry-pXT7質(zhì)粒．類似地,將NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX與本實驗室已有的BbHsp70-pCAG載體重組,獲得BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG質(zhì)粒．

用SmaⅠ線性化eGFP-P2A-mCherry-pXT7質(zhì)粒,再用mMESSAGE mMACHINE T7試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA,1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳定量后分裝,置于-80 ℃冰箱中備用．

1.3 顯微注射與胚胎培養(yǎng)

顯微注射參照Liu等[8]的方法：用200 μL移液槍將文昌魚未受精卵細(xì)胞均勻鋪在涂抹多聚賴氨酸的載玻片上使其成2～3條平行直線,將NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA(約300 ng/μL)和丙三醇按7∶3(體積比)混合后灌入注射器中,灌針完畢后用金屬片開針使其達(dá)到注射要求．注射氣泵充氣完畢后(注射壓強350～450 hPa),通過操作柄將注射針調(diào)至卵細(xì)胞赤道面下方7～8 μm進(jìn)行顯微注射(注射時間為0.1～0.2 s)．注射結(jié)束后立即向培養(yǎng)皿中滴加5～10 μL精液受精,同時在另一培養(yǎng)皿中對同一雌性個體所產(chǎn)的卵細(xì)胞用同樣的方法受精作為對照[8]．體視顯微鏡(SZX7型,Olympus公司)下觀察到受精膜舉起后即刻更換新鮮海水,以徹底去除過量的精液和溶解在海水中的多聚賴氨酸,同時清除顯微注射時損壞的卵,然后將受精卵置于25 ℃濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．在胚胎發(fā)育期間,熒光體視顯微鏡(SZX10型,Olympus公司)下觀察胚胎發(fā)光情況．

注射BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG質(zhì)粒(約340 ng/μL)的方法同上,注射組和對照組的卵細(xì)胞在同樣的條件下受精、培養(yǎng),胚胎發(fā)育至原腸胚早期時35 ℃熱激0.5 h,以誘導(dǎo)BbHsp70啟動下游基因表達(dá)[12],然后在胚胎發(fā)育不同時期,熒光體視顯微鏡下觀察胚胎發(fā)光情況．

1.4 激光共聚焦顯微觀察

選取有熒光蛋白表達(dá)的胚胎在4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛-嗎啉丙磺酸溶液(PFA-MOPS,pH=7.4)中室溫固定0.5 h后,轉(zhuǎn)至丙三醇中終止固定；觀察前將胚胎用含0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST,pH=7.4)洗凈,再用1 μg/mL DAPI染液進(jìn)行細(xì)胞核染色15 min以勾勒胚胎輪廓；然后于80%(體積分?jǐn)?shù))丙三醇中,激光共聚焦顯微鏡(LSM780型,Zeiss公司)觀察、拍照,其中觀察eGFP的波長為488 nm,觀察mCherry的波長為543 nm,觀察DAPI的波長為358 nm．

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)實驗

分別收集注射組和對照組的8體節(jié)時期神經(jīng)胚各200枚,經(jīng)RIPA(radio immunopreciptation assay)裂解液裂解,12 000 r/min離心取上清,獲得可溶性總蛋白；BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度,取50 ng總蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉；一抗雜交(anti-eGFP按1∶1 000稀釋),洗膜,二抗雜交(羊抗鼠actin按1∶5 000稀釋),洗膜,加HRP-ECL顯色底物,暗室內(nèi)顯色．

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段PCR擴增與質(zhì)粒構(gòu)建

以pSYC-97質(zhì)粒為模板,擴增NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX目的片段,大小為1 665 bp,1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物符合預(yù)期大小,無雜帶(圖1)．

(a)原腸胚中期；(b)神經(jīng)板時期；(c)5體節(jié)時期.圖中標(biāo)尺均為100 μm.圖2 NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA注射后在文昌魚胚胎中的表達(dá) Fig.2NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA expression in amphioxus embryos after injection

目的片段經(jīng)雙酶切后連入pXT7載體中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后取陽性單克隆測序,結(jié)果證實目的片段正確插入pXT7載體中．用同樣的方法構(gòu)建BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG重組表達(dá)載體并經(jīng)測序驗證.2個重組質(zhì)粒圖譜見附錄圖S1(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20180107.html)．

2.2 外源mRNA在文昌魚胚胎內(nèi)翻譯表達(dá)eGFP和mCherry蛋白

將由體外轉(zhuǎn)錄所得的NLS-eGFP-P2A-mCherry-

M.D2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);NC.陰性對照;F.目的片段．圖1 PCR擴增NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX目的片段 Fig.1PCR amplification of NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX

CAAX mRNA注入文昌魚未受精卵細(xì)胞,受精后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至胚胎發(fā)育不同時期,熒光體視顯微鏡下選取有熒光的原腸胚中期、神經(jīng)板時期和5體節(jié)時期的胚胎,于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照,結(jié)果如圖2所示．當(dāng)胚胎發(fā)育至原腸胚中期時即可觀察到eGFP發(fā)出的綠色熒光和mCherry發(fā)出的紅色熒光,此時2種熒光均較微弱,隨著胚胎發(fā)育時間的推移,2種熒光的亮度都不斷增加;而未注射的對照組中只能觀察到極其微弱的綠色熒光,這是文昌魚自身發(fā)出的本底熒光[12],對外源GFP發(fā)出的綠色熒光觀察影響不大．

2.3 重組eGFP和mCherry蛋白在胚胎中的定位

如圖3所示:當(dāng)注射NLS-eGFP-P2A-mCherry-CAAX mRNA的文昌魚胚胎發(fā)育至神經(jīng)板時期時,可見較強的綠色和紅色熒光(圖3(a)),表明外源mRNA已翻譯所編碼的蛋白,但此時這2種熒光在細(xì)胞中均主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，沒有明顯差異;當(dāng)胚胎發(fā)育至5體節(jié)時期時,可以觀察到綠色熒光主要集中到細(xì)胞核內(nèi),而紅色熒光則主要集中到細(xì)胞膜上(圖3(b)),說明該時期的胚胎中重組eGFP和mCherry蛋白已被剪切開,在各自連接的信號肽作用下分別定位到細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞膜上．

(a)神經(jīng)板時期;(b)5體節(jié)時期.圖中標(biāo)尺均為20 μm．圖3 重組eGFP和mCherry蛋白 在文昌魚胚胎細(xì)胞中的分布 Fig.3Distribution of recombinant eGFP and mCherry proteins in amphioxus embryonic cells

2.4 文昌魚胚胎中P2A介導(dǎo)的2種熒光蛋白剪切效率

(a)GFP;(b)actin.M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).圖4 文昌魚胚胎8體節(jié)時期P2A剪切效率 Fig.4The efficiency of P2A cleavage in the 8-somite-stage embryos

鑒于胚胎在5體節(jié)時期即可觀察到上、下游蛋白被剪切開的現(xiàn)象,為進(jìn)一步檢測P2A介導(dǎo)的上、下游蛋白在文昌魚胚胎中的剪切效率,收集了mRNA注射組和對照組8體節(jié)時期的胚胎各200枚,提取總蛋白后用Western blot方法檢測胚胎中eGFP和mCherry蛋白的剪切效率,結(jié)果如圖4所示:在注射組35 ku處有已剪切的eGFP,70 ku處有少量未剪切的eGFP；45 ku處條帶為文昌魚內(nèi)源GFP蛋白[12],相對于外源的eGFP少很多．經(jīng)Image J軟件分析比較條帶灰度值,P2A剪切效率達(dá)到91%,略小于其在斑馬魚中100%的剪切效率[10]．

2.5 BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG在文昌魚胚胎中的表達(dá)

檢測BbHsp70與P2A結(jié)合構(gòu)建的表達(dá)載體BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG在文昌魚胚胎中的表達(dá)效果,結(jié)果如圖5所示：當(dāng)胚胎發(fā)育至神經(jīng)板時期,BbHsp70即可很好地啟動下游P2A連接的融合蛋白表達(dá);待胚胎發(fā)育至5體節(jié)時期,eGFP和mCherry蛋白已分別定位到細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞膜上．

3 討 論

頭索動物文昌魚是研究脊椎動物起源進(jìn)化和發(fā)育的一種重要模式動物．雖然文昌魚的分子生物學(xué)研究中已有胚胎顯微注射技術(shù)[9]、BbHsp70介導(dǎo)的過表達(dá)技術(shù)[13]、Talen介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)[14]及Tol2轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲入技術(shù)[15],但分子生物學(xué)研究的技術(shù)手段依然缺乏,從而大大阻礙了文昌魚作為模式動物的應(yīng)用．

(a)神經(jīng)板時期，標(biāo)尺為100 μm；(b)5體節(jié)時期，標(biāo)尺為100 μm；(c)5體節(jié)時期，標(biāo)尺為50 μm.圖5 共聚焦顯微鏡觀察BbHsp70啟動的下游熒光蛋白表達(dá) Fig.5Observation of the fluorescent protein expression initiated by BbHsp70 under a confocal microscope

在轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建過程中,為方便目標(biāo)基因的檢測,常需要以GFP、RFP和YFP等示蹤熒光蛋白與目標(biāo)基因所編碼的蛋白同時表達(dá),這就依賴于一個介導(dǎo)多基因同時表達(dá)的載體．目前構(gòu)建多順反子載體的方法主要包括:構(gòu)建多啟動子(multiple promoters)表達(dá)載體、構(gòu)建剪切(splicing)載體、表達(dá)融合基因(fusion gene)以及基因之間以IRESs或自剪切P2A連接等[16]．其中P2A具有序列短,高裂解活性,上、下游基因表達(dá)量相同的優(yōu)點[3];并且已經(jīng)證實如果需要3個以上基因同時表達(dá)時,可以選擇不同屬的P2A打破序列同源性以協(xié)助維持外源基因插入的穩(wěn)定性[17]．

在將前人報道的P2A介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體[10]引入文昌魚轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炑芯繒r,發(fā)現(xiàn)該載體在文昌魚中的工作效率極低,故本研究用該系統(tǒng)中的P2A與本實驗室此前已構(gòu)建的BbHsp70-pCAG載體重組,重構(gòu)了一個由源于文昌魚熱激啟動子啟動的新載體BbHsp70:eGFP-P2A-mCherry-pCAG．結(jié)果顯示：由P2A連接的上、下游蛋白在文昌魚體內(nèi)的剪切效率達(dá)到91%,并可分別定位于細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞膜上;此外，通過熱誘導(dǎo)方式啟動基因表達(dá),不但表達(dá)效率高,而且可實現(xiàn)在特定時間啟動基因表達(dá)．由此,本研究成功構(gòu)建了一個P2A介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體,為文昌魚研究提供了一種高效、可控并能同時平衡表達(dá)2個蛋白的應(yīng)用體系．

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