人工細胞的表型測試與分選：構(gòu)建從光譜學(xué)到遺傳學(xué)的橋梁

2018-02-08 11:42馬波徐健

中國科學(xué)院院刊 2018年11期

馬波徐健

中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所單細胞中心青島 266101

合成生物學(xué)的核心使命是在闡明并模擬生物合成基本規(guī)律的基礎(chǔ)之上，人工設(shè)計并構(gòu)建新的、具有特定生理功能的生物系統(tǒng)，從而建立藥物、功能材料或能源替代品等的生物制造途徑[1]。其技術(shù)的跨越式發(fā)展，取決于“基因型設(shè)計”“基因型合成”與“細胞表型測試”這三大共性技術(shù)環(huán)節(jié)（design-build-test）的突破[2]。近年來，隨著基因組測序與合成在通量與成本上的大幅度改進，以及基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，業(yè)界設(shè)計和構(gòu)建突變體甚至人工細胞的能力已經(jīng)突飛猛進[3-6]。然而，細胞表型測試速度與通量的發(fā)展卻緩慢得多，有時候甚至落后幾個數(shù)量級。例如，從基因型突變體庫來篩選目標(biāo)表型組合的細胞通常需要花費大量的人力、經(jīng)費和時間（生產(chǎn)抗瘧藥前體的微生物細胞工廠的篩選約動用了 150 人年的工作量[7,8]）。因此，細胞表型測試已經(jīng)成為合成生物技術(shù)發(fā)展的“限速步驟”之一。

1 人工細胞表型測試技術(shù)的現(xiàn)狀

1.1 基于光譜的單細胞表型測試

無論是從天然環(huán)境中尋找、識別和鑒定生物元件與模塊，還是表征、理解和篩選人工設(shè)計的基因回路與網(wǎng)絡(luò)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一均是其活性以及功能在活體細胞內(nèi)的快速測試與評價。單個細胞是地球上生命的基本單元和進化的基本單位，因此，單細胞分析技術(shù)，即在單個細胞精度上的功能識別與表征，能夠在最“深”的水平挖掘生命元件、刻畫細胞功能與理解生命過程。同時，單細胞分析不依賴于細胞培養(yǎng)而直接分析每個細胞個體的功能，因此能夠克服環(huán)境中大部分微生物細胞尚難培養(yǎng)這一挑戰(zhàn)，這對于從人體與環(huán)境微生物組中挖掘生物元件、模塊或底盤細胞具有重大的意義。

1.1.1 單細胞檢測分析技術(shù)的特征

對于細胞功能的快速測試與評價而言，理想的單細胞分析技術(shù)需要具備 6 個特征：① 活體檢測。在很多情況下，元件與模塊的功能，只有在活體細胞中進行非侵入式（即對細胞狀態(tài)的擾動最小化）的測量與探究才具有生物學(xué)意義。同時，活體檢測意味著，經(jīng)檢測后的細胞可直接進行后續(xù)培養(yǎng)或其他操作。② 不需標(biāo)記。如前所述，從天然元件的挖掘角度講，自然界中微生物細胞具極大遺傳多樣性，并且通常尚難以培養(yǎng)，因此目前尚無對復(fù)雜微生物組中的細胞類型廣譜適用的細胞標(biāo)記手段。從基于大腸桿菌、酵母等底盤細胞的基因功能篩選角度講，與潛在需要測量的細胞功能相比，能夠利用熒光探針等對細胞進行標(biāo)記的表型與功能仍極為有限。因此，非標(biāo)記式的細胞檢測具有重要優(yōu)勢。③ 提供全景式的表型信息。研究人員感興趣的許多細胞功能是由多個表型共同反映或決定的，如果只測量單一的表型或單個化合物、蛋白、基因的表征，往往難以探測目標(biāo)功能，而同時能提供多種表型乃至測量表型組的“全景式”分析則具有重要的優(yōu)勢。④ 能分辨復(fù)雜功能。許多重要甚至核心的細胞功能由多個基因共同反映或決定，因此針對單一蛋白或化合物分子的檢測經(jīng)常難以分辨與識別這類功能。⑤ 快速、高通量與低成本。平板上的一個菌落中可包括109個細胞，因此單細胞精度的表型分析對于速度、通量和成本提出了比單菌落層面更高的要求。⑥ 與單細胞功能基因組分析聯(lián)動。單細胞精度的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)、代謝組、表觀組等是生命科學(xué)方法學(xué)研究前沿進展最迅速的領(lǐng)域之一[9]。如果能夠通過細胞分選，將單細胞表型或表型組的分析與這些單細胞功能基因組手段直接對接，將能夠在真正意義上建立單細胞精度的“表型-基因型”模型，從而帶來細胞個體、細胞群體乃至細胞群落層面合成生物學(xué)的突破。

1.1.2 單細胞光譜檢測技術(shù)的類型

代謝物是細胞中基因表達的最終產(chǎn)物，也通常是細胞表型與功能的最直接載體，因此代謝物組的檢測，包括代謝狀態(tài)的識別，是細胞功能檢測最直接、最有效的手段之一[10]。目前在人工細胞測試的流程中，通常用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）或核磁共振（NMR）對細胞“群體”或“群落”進行系統(tǒng)分析，從而實現(xiàn)細胞功能的檢測[11]。但是單個細胞尤其是單個微生物細胞的代謝物極為微量，而且難以像核酸那樣進行擴增，因此，受到現(xiàn)有質(zhì)譜、色譜與核磁檢測靈敏度的限制，單細胞代謝組分析目前仍然存在困難[12]。此外，這些方法的前提通常是裂解細胞以提取或制備胞內(nèi)代謝物，因此難以和目標(biāo)單細胞的后繼培養(yǎng)或基因組與轉(zhuǎn)錄組分析直接對接。而單細胞光譜則是在特定時間、空間與狀態(tài)下針對一個單細胞采集的分子光譜，能夠體現(xiàn)與展示胞內(nèi)代謝物（組）的特征，而且測量過程可以是非侵入性、非破壞性乃至維持活體狀態(tài)，故通過光譜激活的細胞分選能夠?qū)⑻囟ü庾V的細胞分離出來，進而與單細胞培養(yǎng)和各種破壞性的單細胞功能基因組分析直接對接。因此，單細胞光譜技術(shù)是克服上述挑戰(zhàn)的有效手段。

（1）基于熒光光譜的細胞功能檢測。熒光光譜具有靈敏度高、特異性好、分析通量高等優(yōu)勢，是目前應(yīng)用最為廣泛的單細胞表型檢測技術(shù)之一[13]。然而大多數(shù)細胞均沒有自熒光，通常需要設(shè)計熒光探針，對細胞進行熒光標(biāo)記。常用的細胞熒光探針包括小分子熒光染料和熒光蛋白等。部分小分子熒光染料能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部直接標(biāo)記目標(biāo)分子，如小分子酶熒光探針可對細胞內(nèi)的酶進行檢測和成像[14]。此外，小分子熒光探針也可通過連接抗體，特異性地標(biāo)記細胞表面抗原，從而實現(xiàn)細胞功能檢測。熒光蛋白（如綠色熒光蛋白）是另一類重要的熒光探針，常作為報告基因與目標(biāo)基因進行融合表達，以檢測目標(biāo)基因在細胞中的表達情況，從而刻畫基因表達的動態(tài)過程及其功能異質(zhì)性。熒光蛋白也可檢測細胞內(nèi)代謝小分子。例如，一系列特異性檢測評價輔酶 NADPH 的高性能遺傳編碼熒光探針 iNap，實現(xiàn)了在活體動物、活細胞及各種亞細胞結(jié)構(gòu)中對 NADPH 代謝的高時空分辨檢測與成像[15,16]；可基因編碼的多巴胺熒光探針和新型乙酰膽堿熒光探針，能在果蠅、斑馬魚和小鼠中檢測內(nèi)源多巴胺和乙酰膽堿的動態(tài)變化[17,18]。目前，基于熒光探針的細胞功能檢測已被廣泛應(yīng)用于基因的表達調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位與轉(zhuǎn)運、蛋白折疊、信號傳導(dǎo)、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用和細胞代謝動態(tài)過程檢測等研究領(lǐng)域。盡管基于熒光光譜的細胞功能檢測具備諸多優(yōu)點，但是，需要預(yù)知生物標(biāo)示物，需要對細胞進行標(biāo)記甚至是遺傳操作，以及通常只能同時檢測少數(shù)標(biāo)記分子等前提條件也從原理上限制了熒光檢測在生物元件挖掘與細胞表型檢測中的廣泛應(yīng)用。對于自然界中絕大部分的微生物細胞，其生物標(biāo)識物經(jīng)常未知，也沒有普適性的細胞標(biāo)記方法，因此熒光檢測的細胞類型適用范圍相對較窄。即使對于大腸桿菌、酵母等常見的底盤細胞，構(gòu)成細胞表型組的大部分表型，如各種底物的代謝活性、代謝產(chǎn)物譜、環(huán)境應(yīng)激性、細胞間互作等，通常也難以用一種通用的熒光標(biāo)記的方法來直接測量，往往需要構(gòu)建獨立的細胞熒光傳感器。而在細胞中導(dǎo)入基于熒光的胞內(nèi)傳感器，通常需要通過轉(zhuǎn)錄因子等的設(shè)計和改造，將特定代謝物含量等信息轉(zhuǎn)換為細胞的熒光強度[19]；這種對細胞進行 DNA 轉(zhuǎn)化乃至遺傳操作的前提，限制了適用的細胞類型與應(yīng)用場景。尤其重要的是，出色的靶標(biāo)分子特異性與多靶標(biāo)同時檢測可能是相互排斥的，由于多色熒光之間的相互干擾，目前多個基因功能表型的同時檢測還無法廣泛應(yīng)用[20]，難以實現(xiàn)針對表型組的“全景式”測量。

（2）基于拉曼光譜的細胞功能檢測。拉曼光譜是一種非標(biāo)記的散射光譜，是分子鍵被激發(fā)到虛能態(tài)卻尚未恢復(fù)到原始態(tài)所引起的入射光被散射后頻率發(fā)生變化的現(xiàn)象[21]。每個單細胞拉曼光譜由分別對應(yīng)于一類化學(xué)鍵的超過 1 500 個拉曼譜峰組成，反映了特定細胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的成分及含量的多維信息。代謝物組成能夠?qū)毎頎顟B(tài)、細胞所處的環(huán)境變化，以及遺傳背景做出快速響應(yīng)，所以每個單細胞拉曼光譜可以被視為一張超過 1 500 個“像素”的高分辨率“照片”，用于表征單個細胞的狀態(tài)、表型與功能。一個單細胞拉曼光譜中的每個拉曼譜峰或若干拉曼譜峰的組合均潛在代表一種表型。因此，正如一張肖像照能夠同時展示人臉的諸多特征一樣，單細胞拉曼光譜能潛在同時刻畫與反映細胞的多種表型，實現(xiàn)全景式的表型分析[22]。除此之外，水分子沒有很強的拉曼信號，不會對細胞的拉曼檢測產(chǎn)生干擾。因此，可在細胞的最佳生理狀態(tài)下進行拉曼成像，這使得拉曼光譜用于表征生命體系的應(yīng)用范圍十分廣泛。

對細胞群體而言，在單細胞精度上準(zhǔn)確描述群體細胞的功能表型及其異質(zhì)性至關(guān)重要，拉曼組技術(shù)便能滿足這一需求。所謂拉曼組是指在特定條件和時間點下隨機取樣的單細胞拉曼光譜的集合，在概念上類似于給細胞的群體（ramanome）或群落（meta-ramanome）拍“集體照”[22]。拉曼組相當(dāng)于單細胞精度，可快速、低成本測定與監(jiān)控的“代謝物組”，其變化可反映和表征該細胞體系全景式、幾近無限的“狀態(tài)”與“功能”。例如，拉曼組可以檢測底物代謝活性[23,24]、測定產(chǎn)物含量[25,26]、表征環(huán)境應(yīng)激性（如細胞應(yīng)激狀態(tài)[27]、藥敏性與耐藥性[28,29]等）、細胞間代謝互作[30]等。這些特色充分體現(xiàn)了拉曼組手段與轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等手段的互補性，使其有望成為一種通用手段和嶄新的表型組學(xué)數(shù)據(jù)類型，用以定義、表征乃至監(jiān)測細胞的功能及其異質(zhì)性。

（3）基于紅外光譜的細胞功能檢測。紅外成像通常采用近紅外區(qū)多色光作為激發(fā)光源，激發(fā)樣品中分子能級躍遷，進而檢測其紅外吸收光譜。從 20 世紀(jì) 90 年代起，紅外光譜便開始用于區(qū)分正常和癌變的組織[31,32]。雖然紅外顯微光譜技術(shù)理論上分辨率可達衍射極限，但是目前絕大多數(shù)紅外顯微光譜儀配備的都是傳統(tǒng)的碳硅棒（globar）光源，其熱源溫度僅 1 000—1 500 K，光源亮度較弱，因此當(dāng)測試狹縫調(diào)節(jié)到小于 10 μm（細胞尺寸相當(dāng)）時，其光通量將明顯降低，嚴(yán)重影響單細胞紅外光譜的靈敏度。因此目前顯微紅外光譜大多只能對細胞中色素等紅外吸收高的成分成像，如對雨生紅球藻細胞中類胡蘿卜素的空間分布和含量進行紅外成像[33,34]。

同步輻射作為一種新型的紅外光源，具有光譜寬（10—10 000 cm）、亮度高（比傳統(tǒng)光源高 2—3 個數(shù)量級）、發(fā)散度小以及具有時間結(jié)構(gòu)等優(yōu)良特性。特別是其高亮度的特性十分適合開展單細胞顯微紅外光譜成像研究[35]。不僅可直接獲得細胞內(nèi)的生物化學(xué)信息，還可鑒別和檢測特殊的細胞表型，并且具有亞細胞成像分辨能力。與普通紅外光譜相比，同步輻射紅外光譜在單細胞表型檢測上具有更強大的功能。然而在細胞紅外光譜成像過程中，為了保持細胞的活性，測試往往需要在水溶液中進行的。但是，水分子在 3 000—3 750 cm-1與 1 600—1 700 cm-1光譜處都存在明顯的紅外吸收，故克服這一干擾是細胞紅外成像的關(guān)鍵。微流控芯片技術(shù)能精準(zhǔn)地操控流體，其微通道可準(zhǔn)確控制細胞外水層的厚度，從而最大限度地消除水環(huán)境對細胞紅外光譜的干擾。一系列適合細胞紅外光譜成像的微流控芯片裝置的出現(xiàn)，為高通量單細胞紅外成像奠定了平臺基礎(chǔ)[32,36]。

（4）基于太赫茲光譜的細胞功能檢測。太赫茲（THz）位于電磁波譜的微波和紅外區(qū)域之間，其頻率范圍為 0.3—3×1012Hz，探測細胞內(nèi)部時不受散射限制，因此具有出色的生物組織穿透能力，為原位乃至在體的細胞表型測量帶來了希望。一種耦合腔諧振器系統(tǒng)能在 10 GHz 頻率下快速測量流動的細胞，實現(xiàn)了流動狀態(tài)下小鼠成肌細胞的太赫茲光譜測量[37]。太赫茲光譜測量信號與細胞的體積直接相關(guān)，故為細胞大小分布提供了一種快速準(zhǔn)確的測量方法，其潛在的應(yīng)用包括檢測血液樣本中循環(huán)腫瘤細胞（一般比白細胞大）等。雖然太赫茲光譜成像在細胞原位或在體分析上具有重要潛力，但就已發(fā)表的工作來看，能檢測的細胞表型仍然較少也相對局限，距離現(xiàn)實應(yīng)用尚有距離。

1.2 基于光譜的單細胞表型分選

在基于各種光譜技術(shù)的單細胞功能識別與表征基礎(chǔ)之上，利用光譜激活的細胞分選技術(shù)，能夠分離出特定功能的單細胞，進而測定與該功能相對應(yīng)的基因型，甚至是轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、表觀組等單細胞功能基因組，從而在單個細胞精度上建立“表型-基因型”關(guān)聯(lián)。

1.2.1 熒光激活細胞分選

長期以來，熒光流式分選作為一種主流的細胞分析和分選技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。商品化熒光流式細胞分選儀（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）的檢測和分選通量可達數(shù)萬個細胞/秒，自動化和智能化程度較高，但是儀器成本卻一直居高不下，成為應(yīng)用推廣的重要障礙。近年來由于微流控技術(shù)的引入，F(xiàn)ACS 的成本大幅降低，同時還帶來了靈活、精確等優(yōu)點?；谖⒘骺氐?FACS 通過采用表面駐波聲波三維細胞聚集技術(shù)，使得細胞可在低夾流流速條件下實現(xiàn)精確聚焦，可避免細胞在傳統(tǒng) FACS 中由于高流速、高剪切力帶來的損傷[38]。

近年發(fā)展起來的基于液滴微流控的熒光激活液滴分選（fluorescence-activated droplet sorting，F(xiàn)ADS）技術(shù)由于采用液滴包裹細胞，解決了傳統(tǒng) FACS 難以解決的細胞分泌蛋白或者胞外代謝小分子檢測這一難題，分選通量也可達到 30 kHz[39,40]。經(jīng)過表型檢測分選后，單個細胞仍被包裹在單個液滴中，保持獨立性，并能與下游單細胞培養(yǎng)、測序等組學(xué)研究無縫銜接?；?FADS 平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細胞 U937 對藥物庫的毒性表型檢測分選[41]，從定向進化的酵母突變體庫中（數(shù)量約為 108個突變子）檢測篩選具有高辣根過氧化物酶活性的突變體[42]等。也有報道在 FADS 平臺上集成雙通道檢測系統(tǒng)，從定向進化的突變體庫（約 107個突變子）中篩選到優(yōu)先生產(chǎn)布洛芬對映異構(gòu)體的高對應(yīng)選擇性的酯酶[43]。最近，通過耦合 FACS 和人工智能技術(shù)，在基于高通量高分辨度圖像處理的單細胞表型檢測分選平臺（intelligent imageactivated cell sorting，IACS）上，示范了衣藻突變體庫的多參數(shù)智能化篩選[44]。概言之，F(xiàn)ACS 加速了合成生物學(xué)“檢測”的環(huán)節(jié)，使之得以匹配“設(shè)計”和“合成”的通量，促進了合成生物學(xué)的發(fā)展。但如前所述，由于受制于 FACS 需要熒光探針和標(biāo)記細胞，同時檢測的表型數(shù)目很有限等原理上的局限，亟須發(fā)展基于非標(biāo)記式光譜識別、全景式表型分析、廣譜適用于自然界所有細胞的細胞分選技術(shù)。

1.2.2 拉曼激活細胞分選

如前所述，拉曼光譜是一種無損非標(biāo)記的單細胞表型識別手段，在基于微生物組或工程細胞庫的細胞功能篩選中均具有廣闊的應(yīng)用前期[22]。如何在拉曼識別后高通量地分選目標(biāo)表型細胞，即拉曼激活細胞分選（Raman-activated cell sorting，RACS）[45,46]，并用于下游培養(yǎng)、組學(xué)分析等環(huán)節(jié)，對于細胞表型測試平臺的構(gòu)建同樣重要。近年來，一系列基于拉曼光譜的單細胞分選技術(shù)和核心器件先后面世，其中包括拉曼光鑷分選[47-50]、拉曼彈射分選（RACE）[23]、拉曼光鉗液滴分選（RAGE）、拉曼微流分選（RAMS）[51,52]、拉曼微流液滴分選（RADS）[53]等。這些新工具有效耦合了單細胞拉曼表型測量和基因型分析（或培養(yǎng)），為在單細胞水平解析表型和基因型的關(guān)系提供了重要手段。

拉曼激活彈射分選（RACE）[23]，其基本原理是在拉曼測量基片上濺射一層薄膜，將樣品點在該薄膜上并封裝接收微孔陣列；對細胞進行拉曼檢測后，特定細胞可通過施加一束脈沖激光在目標(biāo)細胞位置的基體芯片上；該細胞將被彈射剝離到收集微孔內(nèi)，可靈活實現(xiàn)單個微孔內(nèi)收集單個細胞或多個細胞。受光斑尺寸的影響，直接彈射一般用于小細胞的彈射分離，針對大細胞及細胞團，可對目標(biāo)細胞區(qū)域先進行激光切割（RAMD），然后進行彈射。該方法操作相對靈活簡單，分選準(zhǔn)確率高。然而，拉曼分析分選時的激光輻射對細胞的生理活性會造成一定損傷[54]，而在 RACE 的干片模式下，導(dǎo)熱散熱較為困難，輻射造成的細胞活性損傷有可能更為顯著。此外，由于激光輻射引起胞內(nèi)核酸損傷等可能原因，彈射后細菌單細胞測序的覆蓋度一般不超過 20%，因此基因組拼裝相對困難[23,55]。

拉曼激活光鑷液滴分選（RAGE），是筆者團隊新近開發(fā)的一種耦合拉曼光鑷和液滴單細胞包裹導(dǎo)出的拉曼細胞分選技術(shù)。RAGE 克服了單一光鑷力難以實現(xiàn)目標(biāo)細胞脫離焦平面導(dǎo)出的問題，通過耦合液滴微流控技術(shù)，完成了目標(biāo)單細胞的精準(zhǔn)分選和快速導(dǎo)出。同時，拉曼檢測于水相中進行，能最大限度地保持細胞生理活性，并能夠精確匹配每個細胞與之相對應(yīng)的拉曼光譜表型，實現(xiàn)“所測即所得”。此外，分選后的單細胞已經(jīng)包裹在油包水微液滴中，因此可直接耦合后續(xù)的單細胞培養(yǎng)和組學(xué)分析。我們的數(shù)據(jù)表明，細菌細胞通過 RAGE 系統(tǒng)分選之后其存活率基本不受影響，可直接耦合下游的單細胞培養(yǎng)。而在與 RAGE 直接耦合的單細胞核酸擴增與測序中，可能是由于液相拉曼檢測對于目標(biāo)細胞的保護作用，目標(biāo)大腸桿菌單細胞的全基因組測序覆蓋率有了大幅度提高（可達約 95%）。

前兩種拉曼細胞分選技術(shù)均是在細胞靜止或相對靜止?fàn)顟B(tài)下完成，其通量尚無法滿足高通量的細胞表型功能分選需求。發(fā)展流式拉曼單細胞分選技術(shù)是必然趨勢，但受限于拉曼信號弱這一先天性缺點，首先需要解決高速流動狀態(tài)下細胞拉曼采集這一瓶頸問題。我們開發(fā)了一種基于介電單細胞捕獲/釋放的拉曼激活微流分選（RAMS）技術(shù)，解決了上述瓶頸，率先實現(xiàn)了拉曼流式細胞分選[51]。該 RAMS 系統(tǒng)集成了基于介電的單細胞捕獲釋放單元，可實現(xiàn)高速流動狀態(tài)下單細胞的捕獲，從而完成拉曼信號獲取。在此基礎(chǔ)上，我們進一步建立了拉曼激活液滴分選（RADS）技術(shù)，提高了拉曼細胞分選通量和系統(tǒng)的穩(wěn)定性[53]。由于采用介電液滴分選技術(shù)，RADS 系統(tǒng)是目前已報道工作中全譜分選通量最高的 RACS 系統(tǒng)，通量達數(shù)百個細胞每分鐘，與此同時，針對雨生紅球藻中蝦青素含量的分選準(zhǔn)確率達到 95% 以上，分選后細胞存活率達 93%[53]。值得一提的是，目前該分選通量主要受限于拉曼檢測而非系統(tǒng)本身，通過與高靈敏拉曼檢測技術(shù)（如受激拉曼等）[56]耦合，可實現(xiàn)超高通量分選。

上述 RACS 技術(shù)家族的建立與拓展為人工細胞表型檢測和篩選提供了新的、強有力的技術(shù)手段，也為目前 FACS 尚難于解決的應(yīng)用提供了全新的解決方案[57]。但是僅憑上述單元技術(shù)尚無法直接滿足人工細胞的表型篩選的現(xiàn)實需求，亟須針對合成生物技術(shù)的現(xiàn)實需求，構(gòu)建基于上述單細胞拉曼分選關(guān)鍵技術(shù)的細胞篩選全流程和裝備系統(tǒng)。

1.2.3 其他非標(biāo)記式的細胞功能檢測與分選方法

細胞表型與功能的差異，除體現(xiàn)于光譜性質(zhì)的不同外，還可能導(dǎo)致細胞物理性質(zhì)的變化。因此，通過單細胞物理參數(shù)的測量，也可識別與分選細胞表型。如單細胞電阻抗可反映細胞狀態(tài)，與細胞大小、生長階段等多種表型直接相關(guān)，已被用于分選人體正常細胞與腫瘤細胞[58]。同樣，正常細胞和腫瘤細胞的單細胞力學(xué)參數(shù)有異，細胞形變能力等參數(shù)已展示出腫瘤診斷的潛力[59]。

上述基于細胞電阻抗、力學(xué)形變能力等物理性質(zhì)也被已經(jīng)應(yīng)用于細胞功能分選。不同的單細胞操控力場如光鑷力、電場力（介電場等）、聲波（表面駐波）、流體力場、磁場等均可以方便地集成到微流控芯片系統(tǒng)中，從而實現(xiàn)高通量、高精準(zhǔn)的單細胞功能分選[60]?？傮w而言，為了適應(yīng)千變?nèi)f化的細胞表型分選需求，基于新概念或新原理的單細胞功能分選技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并向著高信號特異性、高檢測動態(tài)范圍、非標(biāo)記、全景式、高通量、人工智能化等目標(biāo)方向不斷推進[36,53,56,61]。

2 人工細胞表型測試方法學(xué)的瓶頸和發(fā)展方向

針對活體無損、非標(biāo)記式、提供全景式表型、能分辨復(fù)雜功能、快速高通量且低成本、能與組學(xué)分析聯(lián)動等挑戰(zhàn)，單細胞光譜成像與分選具有重要的特色與優(yōu)勢。這一貫通光譜學(xué)與遺傳學(xué)、連接單細胞表型組與單細胞功能基因組的橋梁，正在迅速延伸與拓寬。然而，其潛力的挖掘與實現(xiàn)還需要諸多方面的努力，同時也帶來了巨大的機遇。

（1）基于光譜的單細胞表型組測量。一方面，多種熒光探針的并行或復(fù)合使用，能夠拓展在單細胞中同時檢測的靶標(biāo)分子數(shù)目；但是，由于多色熒光之間的相互干擾，多個基因功能表型的同時檢測仍然是重要挑戰(zhàn)[22]。另一方面，盡管基于單細胞拉曼光譜的拉曼組能夠在無需探針的前提下測量底物代謝活性、產(chǎn)物譜、環(huán)境應(yīng)激等諸多表型，但是單細胞精度同時測量這些表型的“全景式”表型組分析尚需結(jié)合特定應(yīng)用進行示范。同時，單細胞層面的表型測量不可避免地帶有基因表達的隨機性所引入的噪音，因此，這些噪音的定量和溯源，是從單細胞光譜表型推斷細胞群體或群落層面的表型、乃至區(qū)分單細胞狀態(tài)變化或基因型變化的關(guān)鍵。

（2）“靶標(biāo)分子特異性”與“全景式表型測量”兼顧的單細胞光譜成像?；跓晒馓结樀脑O(shè)計實現(xiàn)靶標(biāo)分子的高特異性檢測是熒光光譜的特色，而拉曼光譜能夠?qū)ψ匀唤鐜缀跞魏渭毎苯臃治龆喾N表型，兩者之間的優(yōu)勢互補、耦合使用，并證明“靶標(biāo)分子特異性”與“全景式表型測量”的兼容性，將大大拓展單細胞科學(xué)與單細胞技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，是很有前景的研究方向。例如，新近提出的生物正交標(biāo)記受激拉曼散射顯微活細胞成像技術(shù)，基于炔基單一化學(xué)鍵標(biāo)記的受激拉曼散射，突破了成像標(biāo)記基團的尺寸極限；而且炔基報告基團幾乎沒有拉曼背景干擾，即在拉曼光譜上“生物正交”。炔基代謝標(biāo)記生物分子技術(shù)和受激拉曼顯微成像技術(shù)的結(jié)合，實現(xiàn)了活細胞的脂類、核酸、蛋白質(zhì)和糖類的特異性拉曼成像[62,63]。同時，熒光光譜和拉曼光譜的聯(lián)用在腫瘤檢測等方面已有一定應(yīng)用[64]。此外，在單細胞水平，光譜參數(shù)與電學(xué)參數(shù)、力學(xué)參數(shù)等的并行測量與分選，將把單細胞表型組在合成生物學(xué)的應(yīng)用推向新的維度，并在動物、植物、微生物等領(lǐng)域的高通量表型監(jiān)測和分子育種等方面作出重要貢獻[65-67]。在基于光譜的單細胞表型組方面，除了多模態(tài)檢測與分選原理及核心器件的創(chuàng)新，人工智能與大數(shù)據(jù)技術(shù)也將發(fā)揮不可或缺的作用[44]。

（3）單細胞“成像—分選—測序—培養(yǎng)—大數(shù)據(jù)”全流程的標(biāo)準(zhǔn)化與裝備化與智能化。首先，在一定程度上，對于拉曼、紅外等非標(biāo)記式光譜來說，單細胞光譜信號質(zhì)量與細胞承受的激發(fā)光能量成正相關(guān)。因此，光譜采集可能對細胞及其核酸造成損傷，導(dǎo)致分選后單細胞培養(yǎng)成活率低、單細胞基因組擴增的效率低，同時也阻礙了光譜采集—分選流程通量的提高。雖然我們的前期數(shù)據(jù)表明，流式拉曼檢測和微液滴包裹能激光照射后細胞的活性[53]并且提高拉曼分選后核酸擴增與測序的質(zhì)量，然而如何在保證細胞活性與信號質(zhì)量的同時，繼續(xù)大幅度提高測量與分選的通量，這仍需要創(chuàng)新的解決方案。另一方面，單細胞拉曼、紅外光譜的測量與分析的方法學(xué)還在不斷優(yōu)化中，其實驗流程、計算分析以及數(shù)據(jù)等方面離標(biāo)準(zhǔn)化均還有相當(dāng)距離。因此，迫切需要通過業(yè)界的合作，種細胞類型和應(yīng)用場景來建立相應(yīng)的光譜采集與分析技術(shù)與裝備標(biāo)準(zhǔn)，為將來基于分子光譜的單細胞“表型組-基因組”大數(shù)據(jù)的大規(guī)模采集與共享奠定基礎(chǔ)。

此外，單細胞光譜測試設(shè)備的原理各異，故適合測量的細胞類型與狀態(tài)也不盡相同。例如，由于光合色素的存在，光合細胞往往需要一個“淬滅”過程才能測量拉曼全譜，有可能影響分析與分選的速度。因此，構(gòu)建一套完全自動化的合成生物鑄造平臺，還需要考慮光譜檢測原理與細胞性質(zhì)之間、各種表型測試設(shè)備之間，以及基因型設(shè)計和合成等環(huán)節(jié)與細胞表型測試環(huán)節(jié)之間，在工作原理、操作過程和分析通量等方面的不同要求。在此基礎(chǔ)上，借助大數(shù)據(jù)和云計算，一系列針對特定單細胞測試、分選、測序與培養(yǎng)需求的新型裝備與技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)將不斷涌現(xiàn)，以支撐合成生物鑄造平臺的規(guī)?；c智能化。

3 結(jié)語

綜上所述，基于光譜學(xué)的非侵入性單細胞功能表征技術(shù)任重而道遠。多種光譜學(xué)之間揚長避短的聯(lián)合作戰(zhàn)，乃至光、電、聲等多模態(tài)成像，結(jié)合高通量的光譜激活細胞分選技術(shù)及下游的單細胞組學(xué)技術(shù)，必將構(gòu)建一條連接光譜學(xué)與遺傳學(xué)的寬廣橋梁，從而為細胞工廠的快速與自動化表征、篩選與機制解析提供新一代的解決方案。

同時，基于這一橋梁，單細胞光譜表型組及其相對應(yīng)的單細胞基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將逐漸積累。這一單細胞精度的“表型組-基因組”作為一種新的生物學(xué)大數(shù)據(jù)類型，將催生一系列嶄新、共性、系統(tǒng)的實驗儀器、計算工具乃至大數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)，加速“數(shù)據(jù)科學(xué)驅(qū)動”的細胞工廠設(shè)計與構(gòu)建，從而推動合成生物學(xué)研究思路與方法的改觀。