陶興玲

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

雷瓊

(湖北省荊州文物保護中心，湖北 荊州 434020)

馬立安

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

土壤微生物資源豐富，每克土壤含有大約107個原核生物細胞，但用傳統(tǒng)的技術培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的0.01%～10%[1]，而大部分的微生物處于不可培養(yǎng)的狀態(tài)，相當多的菌種由于無法培養(yǎng)使之不能被充分地開發(fā)和利用，因此從自然環(huán)境中提取微生物的DNA 對不可培養(yǎng)細菌的檢測、某些目標菌株的跟蹤或重組基因在自然條件下的行為有重要的意義[2～5]。

自20世紀70年代開始，研究者就開始關注土壤微生物DNA的提取方法。目前土壤微生物DNA的提取方法主要有直接法[6]和間接法[7,8]。采用間接法提取的DNA純度比較高，但提取量很少；采用直接法獲得的DNA量大并且能代表大部分的土著微生物種群，但是純度較低。純化是一件繁瑣的事情，目前純化的方法有氯化銫密度梯度超速離心法、PVPP(聚乙烯基吡咯烷酮)法、色譜法、電泳法、試劑盒、透析和過濾法等[9]，但這些純化方法往往造成核酸的大量損失。陳旭玉等[10]介紹的方法不僅可以獲得大片段，并且不需要純化即可直接用于PCR擴增和DNA酶切等后續(xù)操作，每克土壤DNA提取量約為2.1～4.6μg，但是此方法耗費時間長、較繁瑣。本研究在陳旭玉等[10]的方法基礎上，對該方法的SDS裂解細胞溫育時間、PEG沉淀DNA時間、CTAB溶解DNA沉淀溫育時間、異丙醇沉淀DNA放置時間、SDS裂解細胞離心條件以及異硫氰酸胍試劑的加入與否等實驗條件進行了優(yōu)化，旨在建立一種經(jīng)濟、快速、簡單的土壤微生物DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤樣品分為2種：一種采自潛江某油田作業(yè)油井及廢棄老井附近，共采集7個土樣，分別記為：1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#；另一種是采自長江大學西校區(qū)農(nóng)學院實驗基地：麥田、草地、大豆田、玉米田、水稻田、樹林、生活淤泥。土樣采集深度為地表20～25cm，所有樣品無菌密閉保存于4℃冰箱中。

1.2 試劑

主要試劑有十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、異硫氰酸胍,均為分析純級。

1.3 土壤微生物DNA提取方法

原方法：參照陳旭玉等[10]報道的方法。

優(yōu)化后的方法：(1)SDS裂解土壤微生物細胞：稱取10g土壤于50mL離心管，加18.5mL SDS裂解液(0.25mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，4% SDS)，渦旋1.5min，68℃溫育20min，每10min輕輕搖動，7000r/min離心10min，將上清液移入50mL干凈的離心管。(2)PET沉淀DNA去除雜質(zhì)：加0.125倍體積的5mol/L醋酸鉀和0.42倍40% PEG-8000，6000r/min離心15min。(3)CTAB溶解DNA沉淀：加18mL 2×CTAB(2% CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L MEDTA)中溶解沉淀，68℃溫育5min。(4)去除蛋白質(zhì)：加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，輕柔混勻，6000r/min離心10min。(5)異丙醇沉淀DNA：在DNA上清液中加0.6～1.0倍體積的異丙醇，13000r/min離心20min。(6)70%的酒精洗滌DNA沉淀：用70%的酒精洗2～3次，自然晾干，加500μL TE緩沖液或無菌水。

1.4 提取方法的優(yōu)化

優(yōu)化其中一個條件的時候，其他實驗條件參照陳旭玉等[10]的方法，逐條優(yōu)化。實驗過程中，在進行各項條件優(yōu)化以及后續(xù)穩(wěn)定性和可操作性實驗時，均用麥田土壤。

細胞裂解優(yōu)化內(nèi)容為：SDS裂解細胞溫育時間分別設置15、20、25、30、45、60min 6個不同時間段；SDS裂解細胞離心條件分別設置7000r/min 10min、8000r/min 10min、9000r/min 10min、6000r/min 15min 4種不同條件；異硫氰酸胍的加入與否設置加入與不加入2種條件。

DNA提取優(yōu)化內(nèi)容為：PEG沉淀DNA時間分別設置0、5、10、15min 4個不同時間段；CTAB溶解DNA沉淀溫育時間分別設置5、8、11、14min 4個不同時間段；異丙醇沉淀DNA放置時間分別設置0、15、30、45、60、180min 6個不同時間段。

1.5 優(yōu)化提取方法的穩(wěn)定性研究

采取2種重復方式進行實驗,一種是取同一種樣品在3個不同時間操作，每次3個重復。另一種是取同一樣品進行5個重復操作。

1.6 優(yōu)化提取方法的應用性研究

采取不同土質(zhì)的土壤樣品分別進行實驗，一種采自潛江某油田作業(yè)油井及廢棄老井附近的7個土壤樣品，另一種是采自長江大學西校區(qū)農(nóng)學院實驗基地的7個土壤樣品，每個樣品2次重復。

1.7 優(yōu)化提取方法的可操作性研究

3人同時操作，每人重復3個樣品。

1:15min；2:20min；3:25min；4:30min；5:45min；6:60min圖1 不同SDS裂解細胞溫育時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結果與分析

2.1 土壤微生物DNA提取方法的優(yōu)化

2.1.1 細胞裂解優(yōu)化結果

采用6個不同時間段進行SDS裂解細胞溫育時間優(yōu)化，結果如圖1所示。由圖1可知，采用溫育20min 即可達到所需要求，故可將SDS裂解細胞溫育時間從1h縮短至20min。

采用4種不同條件進行SDS裂解細胞離心條件優(yōu)化，結果如圖2所示。由圖2可知，采用7000r/min 10min、8000r/min 10min 均可達到所需要求，最終選擇7000r/min 10min，以通過提高轉(zhuǎn)速縮短離心時間，從而縮短試驗時間。

1：7000r/min10min；2：8000r/min10min；3：9000r/min10min；4：6000r/min15min圖2 不同SDS裂解細胞離心條件下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：加入異硫氰酸胍；2：不加入異硫氰酸胍圖3 加入與不加入異硫氰酸胍下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

采用加入與不加入異硫氰酸胍2種條件進行比較，結果如圖3所示。由圖3可知，不加入異硫氰酸胍試劑對提取結果影響不明顯，因此優(yōu)化的實驗方法不加入異硫氰酸胍，可使該實驗方法更經(jīng)濟。

2.1.2 DNA提取優(yōu)化結果

采用4個不同時間段進行PEG沉淀DNA時間優(yōu)化，結果如圖4所示。由圖4可知，采用0 min 即可達到所需要求，故可將PEG沉淀DNA這一步驟省去，以縮短試驗時間。

采用4個不同時間段進行CTAB溶解DNA沉淀溫育時間優(yōu)化，結果如圖5所示。由圖5可知，采用5min 即可達到所需要求，故可將CTAB溶解DNA沉淀溫育時間從15min 縮短至5min。

采用6個不同時間段進行異丙醇沉淀DNA放置時間優(yōu)化，結果如圖6所示。由圖6可知，采用放置0 min 對提取結果影響不明顯，故可將異丙醇沉淀DNA這一步驟省去，以縮短試驗時間。

1：0min；2：5min；3：10min；4：15min圖4 不同PEG沉淀DNA時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：5min；2：8min；3：11min；4：14min圖5 不同CTAB溶解DNA沉淀溫育時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖1：0min；2：15min；3：30min4：45min；5：60min；6：180min圖6 不同異丙醇沉淀DNA放置時間下的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 優(yōu)化提取方法的穩(wěn)定性

采取2種重復方式進行研究，結果如圖7所示。由圖7可知，同一樣品3個不同時間的3個重復中，條帶8的提取量較差；同一樣品的5個重復中，條帶11的提取效果不佳，其余條帶提取效果均較好，由此可知該方法具有一定穩(wěn)定性。

2.3 優(yōu)化提取方法的應用性

采取不同土質(zhì)的土壤樣品分別進行實驗，結果如圖8所示。由圖8a可知，5#和6#土樣的提取效果較好，其他編號的土樣提取效果一般，但都有提取量，可能由于不同土壤樣品中微生物含量有差異，從而導致提取量不同。由圖8b可知，草地、玉米田、水稻田和生活淤泥的提取效果更好，小麥田、樹林等都有提取量。根據(jù)不同土壤樣品的實驗結果可知，優(yōu)化的實驗方案適用于不同地質(zhì)土壤樣品DNA的提取。

2.4 優(yōu)化提取方法的可操作性

優(yōu)化提取方法的可操作性研究結果如圖9所示。由圖9可知，3人提取的3個樣品中，均有2個樣品提取效果較好，可見該實驗方案對于不同的人員均具有一定的可操作性。

1～3：第1次3的個重復；4～6：第2次的3個重復；7～9：第3次的3個重復；10～14：同一次的5個重復。圖7 穩(wěn)定性DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

a.油井附近土壤樣品1～2：1#；3～4：2#；5～6：3#；7～8：4#；9～10：5#；11～12：6#；13～14：7#

b.實驗基地土壤樣品1～2：麥田；3～4：草地；5～6：大豆田；7～8：玉米田；9～10：水稻田；11～12：樹林；13～14：生活淤泥圖8 不同土質(zhì)的土壤樣品的DNA瓊脂凝膠電泳圖

1～3：分別為同一人；4～6：分別為同一人；7～9：分別為同一人。圖9 不同人員操作提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 2種土壤微生物DNA提取方法的比較

通過對陳旭玉等[10]報道的方法進行單因素實驗，得出了優(yōu)化后的實驗方法。由表1可知，優(yōu)化后方法和原方法相比，實驗時間縮短了250 min，省去了異硫氰酸胍試劑。

表1 2種方法優(yōu)化內(nèi)容與結果比較

3 討論與結論

本研究優(yōu)化了陳旭玉等[10]的方法，優(yōu)化后的土壤微生物DNA提取方法，其穩(wěn)定性、適用性和可操作性均達到滿意的結果。但是判斷該方法的優(yōu)化結果時，單一地從DNA條帶的亮暗來評判，只是定性研究并沒有定量試驗。后續(xù)研究中，如果能夠從DNA的提取量、純度等方面進行試驗驗證，通過定量研究，優(yōu)化的結果將得到更細致的描述。

優(yōu)化后的方法與原方法相比，實驗時間縮短了250min，省去了異硫氰酸胍試劑。因此，優(yōu)化后方法是一種經(jīng)濟、快速、簡單的土壤微生物DNA提取方法。

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[編輯] 余文斌