姜辰，楊浩鵬

缺血性腦血管病嚴(yán)重危害人類的生命安全健康，目前仍缺乏行之有效的治療手段[1]。近年來，腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制被廣泛研究，研究證實(shí)雌激素對于缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，流行病學(xué)上表現(xiàn)為中青年女性比同齡男性的卒中發(fā)生率更低[2-3]。在缺血再灌注損傷中，雌激素受體（estrogen receptor，ER）的表達(dá)異常與缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）相互作用，激活如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞的級(jí)聯(lián)性損傷[4-6]。有研究表明葛根素對局灶性腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用，其在臨床中治療缺血性卒中的作用亦有文獻(xiàn)支持[7-8]。本研究采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察葛根素對ER-α與HIF-1α的表達(dá)及下游炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的影響，探討葛根素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)試劑 健康成年雌性C57BL小鼠180只，體重20～25 g，清潔級(jí)，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。葛根素注射液由浙江康恩貝制藥股份有限公司提供，使用時(shí)根據(jù)劑量用注射用生理鹽水（中國大冢制藥有限公司）稀釋。2，3，5-三苯基四唑氮紅（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（上海靈錦精細(xì)化工有限公司）；總蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；牛血清白蛋白（BSA，碧云天生物技術(shù)研究所）；特超敏化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。實(shí)驗(yàn)所用抗體均購買于Santa Cruz Biotechnology；所用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

1.2.1 葛根素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用 取雌性C57BL小鼠60只，按體重大小編號(hào)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、溶劑對照組、葛根素低劑量組（100 mg·kg-1）、中劑量組（250 mg·kg-1）和高劑量組（500 mg·kg-1），每組12只，神經(jīng)功能評(píng)分后6只用于測定腦梗死體積，6只用于測定腦含水量。對溶劑對照組與葛根素高、中、低劑量組采用線栓法制備缺血2 h再灌注24 h局灶性腦缺血模型。葛根素各劑量組給藥體積均為0.01 ml·g-1，假手術(shù)組和溶劑對照組均給予等體積的生理鹽水，所有實(shí)驗(yàn)組于手術(shù)前30 min腹腔預(yù)防性給藥。

1.2.2 腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α動(dòng)態(tài)表達(dá)的時(shí)程變化 取雌性C57BL小鼠60只，按體重大小編號(hào)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、再灌注2 h組、再灌注6 h組、再灌注12 h組、再灌注24 h組，每組12只，其中6只無任何給藥，另6只于手術(shù)前30 min腹腔注射0.01 ml·g-1生理鹽水作為溶劑對照。對所有再灌注組均缺血2 h后方進(jìn)行再灌注，從而建立不同再灌注時(shí)長的局灶性腦缺血再灌注模型。并在手術(shù)結(jié)束后取腦組織提取蛋白，測定ER-α和HIF-1α蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。

1.2.3 葛根素對腦缺血再灌注損傷后ER-α、HIF-1α表達(dá)及炎癥因子釋放的調(diào)節(jié)作用 取雌性C57BL小鼠60只，按體重大小編號(hào)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、溶劑對照組、葛根素低劑量組（100 mg·kg-1）、中劑量組（250 mg·kg-1）和高劑量組（500 mg·kg-1），每組12只，其中6只用于測定ER-α、HIF-1α表達(dá)水平，6只用于測定炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放。對溶劑對照組與葛根素高、中、低劑量組采用線栓法制備缺血2 h再灌注12 h局灶性腦缺血模型。葛根素各劑量組給藥體積均為0.01 ml·g-1，假手術(shù)組和溶劑對照組均給予等體積的生理鹽水，所有實(shí)驗(yàn)組于手術(shù)前30 min腹腔預(yù)防性給藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 局灶性腦缺血再灌注模型的建立及神經(jīng)功能評(píng)分 采用線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型[9]。主要步驟為分離并暴露小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，由遠(yuǎn)端頸外動(dòng)脈插入制備好的線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈造成大腦中動(dòng)脈閉塞從而缺血。2 h后拔除線栓實(shí)施再灌注。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈。

小鼠于缺血2 h再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分參考Longa評(píng)分法：0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向癱瘓側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走。

1.3.2 腦梗死體積與腦含水量的測定 小鼠于缺血2 h再灌注24 h后斷頭、取腦、冷凍后進(jìn)行冠狀切片，將腦片置于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育約30 min后取出觀察，正常腦組織染為紅色，腦梗死區(qū)不著色。染色腦片置于10%中性甲醛中固定，掃描拍照后應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死面積。根據(jù)公式V=t×（A1+A2+…+An）算出梗死體積V。其中t為切片厚度，A為每個(gè)切片單側(cè)梗死面積，n為單個(gè)鼠腦的切片數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中t=2 mm，n=5。梗死體積百分比（%）=（梗死體積/對側(cè)半球體積）×100%。

小鼠于缺血2 h再灌注24 h后斷頭、取缺血側(cè)腦并稱出濕重。將腦組織放入105℃烤箱內(nèi)烘干24 h后稱出干重。腦含水量=[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測ER-α與HIF-1α表達(dá) 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn)步驟：取小鼠缺血側(cè)皮層組織0.1 g，按總蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，并采用Bradford法測定含量。按30 μg蛋白量上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕法轉(zhuǎn)膜，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。放入5% BSA-TBST封閉液中封閉1.5 h后分別加入一抗（兔抗小鼠ER-α抗體，1∶500；兔抗小鼠HIF-1α抗體，1∶800；兔抗小鼠β-actin抗體1∶2500），4℃搖床過夜。而后加入二抗（山羊抗兔，1∶5000）室溫下孵育1 h，兩次抗體孵育后均用TBST洗膜3次，每次10 min。最后進(jìn)行顯色并用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6含量 按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔建立相應(yīng)TNF-α、IL-1β和IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，取缺血側(cè)腦組織勻漿液離心后的上清液，以不同濃度稀釋后按加樣-甩干-孵育生物素標(biāo)記抗體工作液-甩干-洗板-孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液-甩干-洗板-顯色-讀板的順序，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測各孔吸光度OD450，根據(jù)樣品OD450在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的位置計(jì)算出樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，并根據(jù)組織裂解液濃度計(jì)算出每克腦組織中所含細(xì)胞因子的微克數(shù)（μg·g-1）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用表示。兩組間進(jìn)行組間t檢驗(yàn)；3組及3組以上采用單因素方差分析法，比較顯示有整體差異后，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對腦缺血再灌注損傷后梗死體積、神經(jīng)功能評(píng)分以及腦含水量的影響 TTC染色顯示腦缺血梗死區(qū)域呈蒼白色，溶劑對照組缺血2 h再灌注24 h后，腦梗死體積較手術(shù)組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與溶劑對照組相比，低劑量（P=0.005）、中劑量（P＜0.001）和高劑量（P＜0.001）葛根素組均可降低再灌注24 h后腦梗死體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，表1）。

神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示：與溶劑對照組相比，葛根素可改善小鼠缺血2 h再灌注24 h后的神經(jīng)功能評(píng)分，但僅高劑量組與溶劑對照組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）（表1）。

干濕重法測得缺血2 h再灌注24 h后腦組織含水量結(jié)果顯示：假手術(shù)組腦含水量為（79.2±9.1）%，溶劑對照組缺血側(cè)腦含水量為（85.3±10.2）%，與中劑量（P＜0.001）、高劑量（P＜0.001）葛根素組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α的表達(dá)與葛根素的調(diào)節(jié)作用 Western blot結(jié)果顯示，局灶性腦缺血2 h后，隨著再灌注時(shí)間的增加，相比于假手術(shù)組，手術(shù)組ER-α表達(dá)逐漸降低，HIF-1α表達(dá)逐漸升高，其中再灌注6 h、12 h、24 h三組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＜0.001，缺血2 h再灌注12 h ER-α和HIF-1α表達(dá)變化相比假手術(shù)組最為顯著（圖2）。

葛根素各劑量組均可改善局灶性腦缺血2 h再灌注12 h所誘導(dǎo)的ER-α表達(dá)下調(diào)及HIF-1α表達(dá)上調(diào)，其中中劑量組（P＜0.001）、高劑量組（P＜0.001）的改善作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

2.3 葛根素對腦缺血再灌注損傷后TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響 ELISA結(jié)果顯示，缺血2 h再灌注12 h后，與假手術(shù)組相比，溶劑對照組腦組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。葛根素各劑量組均可降低腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，其中，中劑量組、高劑量組對TNF-α、IL-1β和IL-6均可顯著性下調(diào)（中劑量組vs溶劑對照組TNF-α：P＜0.001；高劑量vs溶劑對照組TNF-α：P＜0.001；中劑量組vs溶劑對照組IL-1β：P＜0.001；高劑量vs溶劑對照組IL-1β：P＜0.001；中劑量組vs溶劑對照組IL-6：P=0.046；高劑量vs溶劑對照組IL-6：P=0.004）。與溶劑對照組相比，低劑量組僅顯著性下調(diào)IL-1β（P=0.030）（表2）。

圖1 腦缺血再灌注損傷后梗死體積示意圖

表1 各組小鼠腦梗死體積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及缺血側(cè)腦含水量的比較

3 討論

缺血性卒中發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高。研究中藥改善腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，可為臨床上缺血性卒中造成的神經(jīng)損傷防治提供新的策略，對有效預(yù)防和治療腦血管疾病、降低腦血管疾病的致死率具有重要意義。

葛根素作為豆科植物葛根中提取的一種黃酮苷，是葛根治療心腦血管疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)之一?，F(xiàn)代研究表明，通過雌激素樣作用，葛根素可降低去勢雌性大鼠腦梗死體積，保護(hù)腦缺血半暗帶神經(jīng)元[10-11]。相關(guān)機(jī)制研究顯示，葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用主要體現(xiàn)為阻止局部炎癥誘發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)并抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制與雌激素樣作用的聯(lián)系尚未明確[12]。

圖2 腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α的動(dòng)態(tài)表達(dá)

圖3 葛根素對腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α表達(dá)的影響

表2 各組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β以及IL-6的比較

2016年心臟病與卒中統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，女性在青壯年時(shí)期（絕經(jīng)前）的卒中發(fā)病率低于同齡男性，而在中老年時(shí)期（絕經(jīng)后）的卒中發(fā)病率與死亡率均高于同齡男性，提示雌激素水平的變化影響女性卒中的發(fā)生發(fā)展[3]。有研究表明，雌激素本身即具有一定的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，如抗炎作用、抗氧化作用、擴(kuò)充腦血管并影響其自主功能調(diào)節(jié)作用[13]。除抗氧化作用以外，雌激素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制大多通過與ER結(jié)合并進(jìn)一步激活下游相關(guān)信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白活性，如雌激素可激活營養(yǎng)剝奪的PC12細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，類雌激素他莫昔芬可激活海馬區(qū)神經(jīng)元的抗凋亡通路[14]。

ER是經(jīng)典的核受體，主要包括ER-α和ER-β，主要分布在細(xì)胞核，通過與雌激素或其類似物特異性結(jié)合后形成激素-受體復(fù)合物，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄。ER在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞如神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛存在，參與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)等功能調(diào)節(jié)[15]。ER-α抑制劑已被報(bào)道可通過調(diào)節(jié)水通道蛋白4（aquaporins 4，AQP4）加重缺血再灌注后的腦損傷，同時(shí)ER-α缺陷型小鼠相比野生型小鼠在雌激素對腦缺血損傷的保護(hù)作用方面也被發(fā)現(xiàn)明顯減弱，顯示ER對腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用[14]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，ER的區(qū)域性表達(dá)下降與缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α上調(diào)密切相關(guān)[16]。HIF-1α作為缺血、缺氧環(huán)境中的重要信號(hào)分子，對缺血缺氧環(huán)境中細(xì)胞的能量代謝、血管收縮控制、血管生成以及細(xì)胞凋亡等方面均具有重要的作用[17]。在改善炎癥方面，HIF-1α不僅可以調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)的重要分子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、一氧化氮，同時(shí)在影響炎癥細(xì)胞因子的釋放以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面也發(fā)揮重要作用[18]。

眾所周知，炎癥因子的釋放在缺血性卒中后期的級(jí)聯(lián)損傷中尤為關(guān)鍵，因此，本研究從葛根素的雌激素樣作用出發(fā)，通過考察其對ER與HIF-1α的作用進(jìn)一步延伸至對炎癥細(xì)胞因子釋放的影響，從而評(píng)價(jià)葛根素防治缺血性卒中的藥效并研究相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素可在腦缺血再灌注條件下同步激活ER并降低HIF-1α表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放，改善神經(jīng)炎癥。由此可以推測，葛根素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ER和HIF-1α的表達(dá)及抑制下游炎癥因子的釋放有關(guān)。

本研究是基于小鼠缺血再灌注模型的基礎(chǔ)研究，僅探討了短期（24 h內(nèi)）葛根素對ER、HIF-1及相關(guān)炎癥因子釋放的影響，因此具有一定的局限性。后期將針對葛根素對缺血性卒中更長期的影響進(jìn)行研究和探索。

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