嚴延生 顏蘋蘋 陳亮 吳守麗 謝美榕 吳婷婷 夏品蒼 邱月鋒

2016年，估計全球累計約存活3800萬HIV/AIDS病例，約有1900萬例 HIV/AIDS病例接受抗病毒治療并取得療效，有效抑制了艾滋病的流行。但仍有半數(shù)HIV/AIDS病例不知自己的疾病狀況或者無法治療；且每天仍有5700例新發(fā)現(xiàn)感染者，已經(jīng)成為全球的一個需要解決的緊迫問題。2014年7月，在澳大利亞墨爾本第20屆全球艾滋病大會上，曾提出將治療優(yōu)先及治療作為預防控制艾滋病的一種手段。2016年7月在南非德班召開的第21屆全球艾滋病大會上，正式提出擴大艾滋病治療并把其作為預防的一種策略（treatment as prevention），要求各國政府共同行動起來。此前，WHO根據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署及相關部門的意見，已制定了2016—2021年加速實施艾滋病防控的3個90%策略，計劃于2030年終止艾滋病、病毒性肝炎等傳染病的流行。這些策略的提出，主要是基于HIV抗病毒治療藥物的有效性，使艾滋病成為一個可治療、可管理的傳染病。但不可否認的是，大多數(shù)中低收入國家要面對藥物治療所產(chǎn)生的重大經(jīng)濟負擔問題，長期服藥帶來的藥物副作用問題，停止藥物治療后病毒反彈等問題的產(chǎn)生，這對艾滋病的消除產(chǎn)生了巨大的影響。

1 分子治療（molecular therapy）

1.1 CCR5基因突變治療

CCR5是 HIV進入細胞最重要的輔助受體。如果CCR5發(fā)生突變，HIV就無法進入細胞，利用這種辦法可以治療艾滋病。全球唯一一例根除性治療的成功病例是一德國人Timothy Ray Brown，他10年前就已被確診為艾滋病，2009年入院治療時是因為患上危及生命的粒細胞白血病?？紤]到該病亦是由于艾滋病引發(fā)，因此異源造血干細胞的移殖進入其療程，其結果該患者的免疫系統(tǒng)被整個取代。由于配型移殖的干細胞CD4T細胞的CCR5有一段32bp缺失，即發(fā)生 CCR5D32純合子（delta32/delta32）的基因突變，該突變使HIV-1不能利用CCR5作為HIV侵入細胞的輔助受體而達到治療目的。經(jīng)這樣的治療，4年內該患者的血液、骨髓和直腸均不能檢出HIV-1，這意味著該患者體內已完全清除了 HIV-1的感染。但一波士頓病人同樣用帶有野生型 CCR5基因突變的異源性的造血干細胞移殖，即使其周圍血細胞只存在不到0.001%受感染細胞，也造成HIV病毒的反彈。也就是說，造血干細胞的移殖無法完全取代原來受感染的免疫系統(tǒng)。另外這種異源性的造血干細胞移殖的根除性治療難度大，首先表現(xiàn)在難以找到可配對的供體；其次該法存在很高的死亡率和發(fā)病率，不適用于對生命威脅不大的多數(shù)病例，所以這種CCR5基因突變的根除性治療方法難以推廣使用。

1.2 細胞或病毒基因組的編輯治療

鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）介導的特異性基因敲除或插入的研究約始于2004年，此后，這種技術已被廣泛地應用于動物基因組的編輯修飾，一般認其為二代基因組編輯。

Tebas等從 Brown的治療得到啟發(fā)，利用自體同源CD4+T細胞敲除 CCR5這個主要輔助受體基因進行人體基因組編輯治療艾滋病，此后，Li等則用該技術對成人造血干細胞敲除 CCR5進行艾滋病治療的研究。在 Tebas等的研究中，共有12例接受HAART治療并呈慢性無病毒血癥的 HIV-1感染者被分為兩個隊列（每個隊列6例，即cohort1和cohort 2），兩個隊列患者每例用100億CD4 T細胞自體細胞輸注，該細胞中含有約11%～18%用ZFN敲除去CCR5基因的細胞。ZFN修飾細胞的半衰期為 48周。其中cohort1在輸注 4個星期后停止HAART治療，第8周時病毒反彈至高峰，12周時病毒血癥呈下降趨勢，此后恢復治療，總觀察期252 d（36周），病毒血癥均降至未能檢出水平；此外cohort1組CD4 T細胞的比例也略高于未中斷治療隊列，可見敲除去 CCR5基因對治療艾滋病是有效的。但隨著時間的推移，需防止嗜CXCR4病毒的發(fā)生。

近年來基因組編輯的技術方法有了很大的發(fā)展，尤其是 CRISPR/Cas9剪切編輯，現(xiàn)稱其為第三代基因組編輯法。它與前述的鋅指核酸酶的一個重要區(qū)別在于該法是對HIV前病毒的剪切消除，且近年已在各種動物的研究中取得令人滿意的結果。

Yin等近期在美國分子治療刊物上發(fā)表的第三代基因組編輯結果令人注目。該研究有4大特點：一是用可傳導4條特異性向導RNAs（sgRNAs）和金黃色葡萄球菌核酸內切酶Cas9（sacas9）的多功能腺相關病毒（AAV）為載體，進行sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8的基因組編輯，其敏感性、特異性效果要比只傳導兩條向導RNA的要好，在人源化的轉基因鼠Tg26培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞或前體細胞中剪切整合的 HIV-1基因組實驗中，未見脫靶（offtarget）現(xiàn)象；其次，在人源化的 Tg26小鼠中靜注 sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8可發(fā)生對HIV-1前基因組的剪切，在多個組織器官中顯著減少了 HIV-1RNA的表達；第三，用 EcoHIV[系用鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV）膜蛋白取代HIV的env膜蛋白構建的HIV-MLV嵌合病毒]急性攻擊小鼠，隨后靜注sgRNAs/saCas9AAVDJ/8可顯著的降低 EcoHIV的感染，用生物熒光顯像法可確定sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8在組織器官中剪除 EcoHIV的效果，PCR分型在試鼠的肝、肺、腦和脾的分型鑒定中也未能檢出EcoHIV；第四，用骨髓、肝、胸腺（BLT）器官人源化的小鼠進行慢性 HIV-1的感染實驗中，即使是單劑量的靜注sgRNAs/saCas9 AAV-DJ/8，PCR分型鑒定也能成功的確定其有效的剪切了在脾、肺、心、結腸及腦組織中的前病毒，認為該法是進行人類臨床試驗前的重要步驟。

2 組合治療（hybrid cure）

在使用現(xiàn)有ART后，HIV/AIDS病例中病毒載量大多可處于＜1000 copy以下，在治療效果好的情況下，血漿中不能檢出RNA，但一停藥，儲存庫中潛伏的病毒就被激活反彈，組合治療的目的在于縮小病毒儲存庫，降低病毒反彈的機率。剝離與消除（kick and kill）或激活與消除（shock and kill）這個混合治療策略的提出具有3個明顯的目標，其一要盡可能的減少HIV病毒潛伏儲存的細胞，其二是要增強機體的免疫應答，以達到在ART治療后對殘存病毒儲存細胞的免疫控制，避免停藥后的病毒反彈。這種策略的實施，前提是 ART，其次用潛伏逆轉劑 （latency reversing agents，LRAs）從藥理學上激活潛伏的前病毒（kick or shock），第三是通過免疫清除或者通過 HIV-1蛋白表達的細胞病理效應來達到消除 HIV潛伏感染細胞的目的。至于所用的LRAs，需要通過臨床治療研究來確定其是否具有消除功能。增強機體的免疫應答，主要還是依賴研制具有廣譜中和抗體（broadly neutral-lizing antibodies，bnAbs）和細胞毒 T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的疫苗。

2.1 LRAs的組合

2.1.1 LRAs的臨床研究當前HIV-1LRAs進行臨床研究最主要的藥劑是一組腫瘤細胞抑制劑，即組蛋白去乙?；种莆铮╤istone deacetylase inhibitor，HDACi），如伏立諾他（vorinostat）、帕比司他（panobinostat）和羅米地辛（romidepsin）等。使用伏立諾他時，感染細胞的HIV-1RNA的表達不正常，雖然重復給藥也難以確定血漿中HIV-1RNA的增加，但該藥確有激活潛伏靜息病毒的作用。HDACi可能比先前所認為具有更長的基因表達效應，隨著HDACi治療的施行，基因失調的時間延長，這種現(xiàn)象可能是由于CTLs功能障礙引起的。使用帕比司他和羅米地辛也同樣顯示細胞表達HIV-1RNA的失調，但與伏立諾他比較，重復給藥后用轉錄介導擴增法（transcription-mediated amplification，TMA）或羅氏 COBAS AmpliPrep/TaqMan可檢出這兩種藥血漿中增加了HIV-1RNA的表達，證實逆轉劑的使用發(fā)揮逆轉了潛伏病毒的功能。雖然雙硫侖并非HDACi類藥物，但也觀察到血漿中的病毒血癥和未剪切的 HIV-1RNA水平升高，具有相似LRAs的功能。

雖然上述 3種逆轉劑的治療效果得以肯定，但在表述時應該很謹慎，部分原因在于檢測血漿中HIV-1RNA 的分析（TMA and AmpliPrep/TaqMan）不能與使用HDACi所產(chǎn)生的 CTLs攻擊 HIV-1潛伏細胞后釋放的病毒 RNA相區(qū)別。簡而言之，是由于儀器的敏感性檢出血漿中 HIV-1RNA還是使用HDACi的結果難以確定；另一個重要的原因是，在HDACi治療后細胞HIV-1RNA的表達可能是所有有關轉錄的結果，而血漿中 HIV-1RNA的增加可能不單純是HDACi治療的結果，而又把它算在HDACi治療的份上。如果是 HDACi治療的結果，細胞HIV-1RNA轉錄的增加與HIV-1蛋白量的增加有關，只有檢測HIV-1蛋白量增加與否，才能肯定是HDACi治療的作用，因此，對逆轉劑的使用需要認真評價。

2.1.2 新的 LRAs的體外評估LRAs臨床試驗的結果一般認為可以作為剝離與消除策略用于艾滋病的組合治療。但HDACi的作用只是目前已知的前病毒潛伏機制逆轉作用中的一種，前病毒潛伏機制復雜并呈多樣性。用苔蘚抑素 1或巨大戟醇衍生物通過蛋白激酶C（PKC）產(chǎn)生的 NF-kB的激動作用可使HDACi作為轉錄因子結合到 HIV-1的長末端重復序列上而發(fā)揮復制作用，可以認為是另一種逆轉HIV復制的治療方法，這個結果已由多個研究團隊互為印證。LRAs單獨使用一般是最有效的，但在苔蘚抑素1或巨大戟醇結合的 HDACi情況下，這兩種藥至少存在協(xié)同作用。因此，對于新的LRAs的使用，評價時首先應保證HIV陽性感染者的健康安全。在動物試驗中治療指標不理想的所謂 LARs不能用于艾滋病治療的臨床研究。在臨床用藥前就必須確定 LARs效果以及在停藥后是否能夠啟動bnAbs或CTLs的免疫應答。

2.2 疫苗的研制

組合治療的另一要素即是bnAbs和細胞毒T細胞（CTLs）的免疫應答，這涉及到疫苗的研發(fā)。目前HIV/AIDS的治療藥物有6大類37種。藥物治療的有效性是公認的，但停藥后，病毒的反彈也是明顯的。長期服藥后，不可否認用藥者可出現(xiàn)副作用和體內耐藥病毒的產(chǎn)生；此外，病毒反彈的結果與潛伏病毒庫的大小密切相關。因此除了不斷發(fā)展新型藥物外，還需要研制有效安全的HIV疫苗，這類疫苗既可作為預防所需，也可作為治療性疫苗使用。從功能學上說，有效安全的HIV疫苗不外乎必須具備體液免疫和細胞免疫兩個主要功能，即前者需要產(chǎn)生bnAbs，而對于治療性疫苗而言，后者需產(chǎn)生CTLs。因為，CTLs必須在各組織器官中巡航，以尋找潛伏病毒庫。

從 1987到2013年，迄今已有27年的歷史共有6種疫苗投入試驗，除在泰國進行的RV144疫苗的現(xiàn)場試驗取得一些成效外，其他均以失敗告終。主要原因是對HIV本身的特征和生命循環(huán)的了解還有欠缺，包括其早期整合入人體基因組、病毒的高度糖基化及致密性、唯一產(chǎn)生中和抗體的包膜（env）刺突序列易變的特性等基礎研究不足，導致研制的疫苗無法進入實用，疫苗的這些問題，雖然在動物研究或實驗室研究都有成功的范例，但在人類應用方面還存在問題。

2.2.1 艾滋病疫苗的殺傷性或CTLs的產(chǎn)生使用RV144時，已經(jīng)考慮了疫苗的細胞免疫問題，所采用的程序為初免及加強免疫。初免時使用3個表達HIV env，gag和pro基因的金絲雀痘載體疫苗，加強免疫時用含HIV-1B/E亞型重組gp120糖蛋白，但在 42個月內也只有約31.2%的有效性，為何未達到期望的效果，應當引起認真的反思。大量的動物研究也給我們另一些有益啟示。第一，ADCC以及其他非中和功能但又攜帶免疫功能細胞的Fc段受體（FcR）可能可抗HIV傳播。因此要加強對疫苗使用新的佐劑的研究，佐劑對CTLs的生成具有重要作用；第二，CTLs可以通過殺傷HIV感染的CD4 T細胞控制病毒載量，用可克服病毒易變性多基因嵌入的“馬賽克”疫苗的初免和加強策略可以大幅度提升人類的 CTLs細胞識別HIV的水平，這個研究成果已在模仿人感染的動物試驗研究中得到證實；第三，用SIV gag插入到減毒的恒河猴巨細胞病毒載體（rhCMV）上具有很明顯的免疫效果，此類疫苗接種后首輪感染 HIV就可見 50%的清除病毒的結果；有意思的是，rhCMV可以大幅度地誘導產(chǎn)生CTLs，而且識別抗原的非典型CD8 CTLs細胞介導了HIV感染靶向細胞的殺傷，但這種在非人靈長類的研究是否適用于人類臨床試驗，目前仍沒有答案。

2.2.2 bnAbs的產(chǎn)生艾滋病疫苗的另一個重要關注點在于bnAbs，因為 bnAbs應對全球不同的分離株都必需起中和作用才有意義。從 2009年始，已大規(guī)模開展了對 HIV感染者 bnAbs的分離分析研究；其次，對 env刺突進行高分辨率結構的分析；第三，是在分子水平上研究bnAbs如何與 env進行結合，其目的在于設計新的免疫原；第四，探究 bnAbs在體內如何與感染者共進化；第五，研究機體如何限制bnAbs的產(chǎn)生；第六，奠基者病毒（TF）傳播擴散的特征；第七，用奠基者病毒包膜研制嵌合的人—猴免疫缺陷病毒（SHIVs），這個研究雖有一定難度，但已被克服。當猴用 SHIVs攻擊時，被動給予試驗組猴bnAbs也可以阻斷SHIVs的傳播，這就提示bnAbs在抗HIV感染傳播的重要性，但目前的疫苗無法誘導機體產(chǎn)生高效價的bnAbs。

誘導 bnAbs的產(chǎn)生的因素是多方面的。首先，免疫原應該具有精確的能產(chǎn)生bnAbs的env表位結構，目前從自然分離的HIV中基本上難以獲得這種免疫原，人工設計免疫原是主要途徑。這種人工設計優(yōu)化的免疫原應當能產(chǎn)生bnAbs，而且抗原抗體關系在分子層面上要能解釋清楚。在實驗室中可獲得可溶性gp140這樣的env衍生物，gp140病毒三聚體（SOSIP）的結構可被結晶化和低溫電鏡（cryo-EM）所見，結晶化結構和低溫電鏡結構應當顯示它們是一致的，都是膜結合三聚體結構，這個分析很重要。SOSIP三聚體只有在這樣一致的狀況才可誘導產(chǎn)生有效的、高效價的bnAbs。遺憾的是，單獨用實驗室提取的SOSIP三聚體免疫兔和猴并不能誘導產(chǎn)生bnAbs，其在提取過程中結構發(fā)生了變化，這就是說，在免疫動物前，兩結構沒有互為比對的結果，SOSIP產(chǎn)生這樣的變構，gp120也是難免的。另外，bnAbs可以與感染的病毒共進化，這就提示最好要用多種人工設計的 env免疫原來誘導 bnAbs的產(chǎn)生。

產(chǎn)生 bnAbs另一個難以逾越的障礙是env的糖蛋白抗原性。env是目前已知天然蛋白中糖基化程度最高的蛋白之一，其被 bnAbs結合的保守位點為多糖遮蓋包埋。因此，有效的bnAbs必須能與多糖反應，最起碼 bnAbs中必須含有與多糖反應并揭開多糖能力的組分。很遺憾的是，env多糖往往是從宿主來的，換句話說，它不是異源的東西，所以它的免疫源性很弱，因此在設計免疫原時應考慮這一問題。

目前已知 env刺突頂部多肽位點有利于啟動對自然感染的抗體反應，通常反應也比較早，且只發(fā)生較低的體細胞突變。然而，這種形式生成的抗體需要對多糖的識別，雖然這種多糖比較單純，主要是甘露聚糖。bnAbs識別包膜糖蛋白41（gp41）-gp120結合界面通常涉及復雜的異構的多糖，因此這類疫苗可能沒有優(yōu)勢。在決定最佳的bnAbs結合位點方面，實驗研究很重要。

2.3 疫苗研制的策略

上述所言，已經(jīng)界定了保護性疫苗的基本原則，因此HIV疫苗研發(fā)的關鍵問題包括：1）已知RV144有一定的抗感染能力，所以應加強對新RV144再試驗的研究，特別是在使用新型佐劑方面要加以考慮；2）應當逐步過渡到人體臨床試驗來確定什么樣的減毒 CMV或其他載體能夠類似猴 CMV載體誘導非典型的CD8 T細胞清除急性HIV的感染的研究；3）應當確定用于誘導bnAbs的env免疫原最佳結構、形態(tài)和序列。以上 3點原則，是研發(fā)實用艾滋病毒疫苗的關鍵所在。

3 發(fā)現(xiàn)潛伏感染病毒細胞的標記

現(xiàn)已認識到，HIV感染者中持續(xù)存在的潛伏病毒庫是HIV治療一大障礙。近期，Descours等發(fā)現(xiàn)了一個新的潛伏感染病毒細胞的標記。在HIV潛伏感染的CD4 T細胞的體外模型中，發(fā)現(xiàn)了 103個上調基因表達識別標記，包括了16個跨膜蛋白基因，而這些基因均是從潛伏感染的細胞表達的，也可以說極具特異性。在這些潛伏感染的CD4 T細胞的體外篩選中發(fā)現(xiàn)他們表達低親和力受體的免疫球蛋白IgG Fc片段CD32A，并呈高度誘導表達，但在非潛伏感染的CD4 T細胞中不表達，這就提供了區(qū)別潛伏感染與非潛伏感染的 CD4 T細胞的重要標記。值得注意的是，CD32A表達產(chǎn)生與常規(guī)經(jīng)T細胞受體感染HIV的途徑無關，提示CD32A產(chǎn)生是依賴于細胞潛伏感染的另一機制。在抗逆轉錄病毒治療有效的 HIV-1感染者血液樣本中，發(fā)現(xiàn)可表達CD32A的細胞約占 CD4 T細胞亞群的0.012%，每個細胞約攜有 3個拷貝的 HIVDNA。此外，在某些受試者中，具有CD32A標記的細胞還占主導地位，這與這些受試者具有的CD32A標記的細胞富含可誘導具有復制能力的病毒有關。研究證實帶有CD32A標記淋巴細胞可以代表難以找到的潛伏感染的HIV-1儲藏庫，這將促進靶向研究來消除具有這一表面標記的潛伏病毒儲藏庫。

4 展望

已有的治療藥物已構成了全球艾滋病的治療體系，目前新的藥物仍在不斷申報研制中，因此，WHO的3個90%的目標如果能夠實現(xiàn)，那在 2030年全球消除艾滋病的愿景可能能實現(xiàn)。本綜述在ART的前提下，分別就分子治療、組合治療及與治療有關的潛伏期感染病毒細胞的標記進行了簡述，無論是目前的藥物治療、還是基因組編輯治療等，都無法治愈艾滋病，歸結到一點，其主要原因均在于存在著潛伏病毒儲藏庫，一旦治療停止，病毒繁殖反彈；而終身服藥治療，難免存在藥物副作用及耐藥病毒產(chǎn)生等問題，所以在有效治療后，如何控制病毒的反彈是一個永恒的話題。因此，努力尋找新的潛伏感染的HIV-1儲藏庫及其標記物，研究控制縮小潛伏感染的儲藏庫藥物和方法，這是目前艾滋病治療方面最大難點。使用載體的分子治療，其對人體健康安全的長遠評估難以預測；使用LRAs的HDACi也是一種化療的方式，同樣，這些治療都難以達到治愈目的。因此，除繼續(xù)加強對上述治療的技術方法進行研究測試外，研制可產(chǎn)生廣譜中和抗體及CTLs疫苗進行控制及監(jiān)視潛伏病毒的細胞，不因病毒反彈而使免疫系統(tǒng)再次受打擊，這才是安全有效可接受的長期艾滋病的管控辦法。