劉雯潔，莫秋玉，林文遠，林 瑋，卓梅芳，劉 源，蔣端鳳，董 敏

(1.桂林醫(yī)學院，廣西桂林 541004;2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液科，廣西桂林 541001)

人體外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是一群具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細胞［1］。多項研究顯示，長期的乙型肝炎病毒(HBV)感染與外周血中血小板減少存在相關(guān)性［2～4］。乙肝病毒感染并發(fā)血小板減少是指伴HBV感染的免疫性血小板減少癥(ITP)［5］，除外 ITP本身疾病因素，乙肝病毒感染可能是本病血小板減少的原因之一［6］。本研究通過檢測12例HBV感染并發(fā)血小板減少患者與10例健康體檢者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達情況，探討HBV感染并發(fā)血小板減少可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗組為12例2017年3～11月在桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院及門診患者，均符合ITP診斷標準［7］，并且乙肝系列檢測HBsAg定量增高，符合HBV感染［8］，其中男性患者7例，女性患者5例，年齡35～85歲。對照組10例為同期體檢的健康個體，男性3例，女性7例，年齡21～75歲。

1.2 試劑和儀器 FITC標記的鼠抗人CD25單抗、PE-Cy5標記的鼠抗人CD4單抗及BD FACSTMLysing Solution(10x)均為 BD Biosciences公司產(chǎn)品;淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司;FACS Calibur流式細胞儀為Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 分離單個核細胞:所有研究對象用EDTA抗凝管抽取靜脈血2.0 ml，加入PBS液2.0 ml稀釋后，用淋巴分離液常規(guī)分離獲得單個核細胞，加入FACSTMLysing Solution(10x)懸浮細胞，使細胞濃度調(diào)整為1.0×107/ml。

1.3.2 細胞免疫熒光染色:取上述懸浮細胞100 μl，分別加入 CD25-FITC，CD4-PE-Cy5 各 20 μl，混勻后室溫避光孵育15 min;加入PBS液500 μl混勻，1500 r/min離心5 min，棄上清。加入0.5 ml PBS充分混勻，懸浮細胞，4 h內(nèi)流式細胞儀上機檢測。

1.3.3 流式細胞檢測:采用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，應用CellQuest軟件分析結(jié)果，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，以CD4和SSC設(shè)門選擇CD4陽性細胞分析CD25表達，分析其中CD4+/淋巴細胞、CD4+CD25+/淋巴細胞及 CD4+CD25+/CD4+比例。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗中的兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果實驗組與對照組比較，CD4+/淋巴細胞比例分別為(24.64+9.8)%和(31.72+6.6)%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(U=33.0，P=0.075)。CD4+CD25+/淋巴細胞比例分別為(4.05+3.7)%和(3.61+1.2)%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(U=51.5，P=0.575)。CD4+CD25+/CD4+的比例分別為(14.97+12.0)%和(11.27+2.8)%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(U=55.0，P=0.742)。

3 討論HBV感染并發(fā)血小板減少狹義上是指ITP并發(fā)乙肝病毒感染，滿足以下3個條件:①符合ITP的診斷;②HBV感染發(fā)生于血小板減少前或同時發(fā)現(xiàn);③無門脈高壓、脾大或肝硬化的證據(jù)(除外脾功能亢進引起的血小板減少)。廣義上的HBV感染并發(fā)血小板減少應包括肝炎病毒感染后出現(xiàn)的、抗乙肝病毒治療有效的血小板減少［5，9］。HBV感染并發(fā)血小板減少是臨床常見血小板減少疾病之一，我們在臨床工作中觀察到抗乙肝病毒治療能顯著提高HBV感染并發(fā)血小板減少治療效果。為進一步探討其可能的發(fā)病機制，本研究首次比較了12例乙肝病毒感染并發(fā)血小板減少患者與10例健康體檢者外周血中CD4+/淋巴細胞、CD4+CD25+/淋巴細胞及CD4+CD25+/CD4+比例，結(jié)果表明上述指標均未顯示明顯差異(P＞0.05)。

研究表明，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平較正常人明顯增高［10］，其機制可能與免疫耐受有關(guān)［11］。此外，ITP發(fā)病時外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達水平較正常人明顯降低［12］，其機制與免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在HBV感染并發(fā)血小板減少患者外周血中比例與正常人無明顯差異。本病既有HBV感染，又符合ITP的診斷，因此我們的研究結(jié)果表明可能是乙肝病毒感染相關(guān)免疫耐受與ITP相關(guān)免疫調(diào)節(jié)異常共同作用的結(jié)果，其發(fā)病可能存在較復雜的免疫紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗乙肝病毒治療后慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+表達水平可逐漸下降，甚至恢復正常［14］。而經(jīng)免疫調(diào)節(jié)治療后，ITP患者外周血CD4+CD25+表達水平可明顯升高，并可恢復正常［15，16］。因此，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細胞在HBV感染并發(fā)血小板減少患者的表達水平與患者的病情、免疫狀態(tài)，及與抗乙肝病毒治療和免疫調(diào)節(jié)治療的關(guān)系，值得進一步研究。