羅 薇

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒感染禽類所致的一種高度接觸性傳染病.OIE規(guī)定一旦發(fā)生新城疫必須報(bào)告，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將此病列為一類疫病，屬國(guó)家中長(zhǎng)期疫病防治規(guī)劃中優(yōu)先防治的5種一類疫病之一.新城疫的防控主要依靠疫苗免疫，以防止易感禽被感染.新城疫的有效免疫需綜合考慮免疫對(duì)象及其養(yǎng)殖環(huán)境，選擇有效的疫苗，制定合理的免疫程序.本文將從新城疫病毒的毒力、疫苗種類、免疫接種及其影響因素等方面對(duì)雞新城疫免疫防制相關(guān)問題進(jìn)行論述，旨在為臨床有效防控雞新城疫提供參考.

1 雞新城疫病毒的毒力

2002年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）將雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）歸類于副粘病毒科（Paramyxoviridae）的成員[1]，病毒全基因長(zhǎng)約 15.0 kb，為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA，病毒粒子由脂質(zhì)雙分子層包裹，包括 NP、P、M、F、HN、L 等6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，與新城疫毒力強(qiáng)弱相關(guān)的主要蛋白是 F和 HN[2].NDV僅有一個(gè)血清型，但不同毒株毒力差異很大.生物學(xué)試驗(yàn)是確定毒力的可靠方法，用1個(gè)最小致死量NDV接種10日齡雞胚，雞胚死亡平均時(shí)間（MDT）≤60 h為強(qiáng)毒，＞90 h為弱毒，介于二者之間為中毒；NDV對(duì)1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）0.0～0.5為弱毒，1.0～0.5為中毒，1.5～2.0為強(qiáng)毒；NDV對(duì)6周齡雞靜脈注射致病指數(shù)（IVPI）0.00為弱毒，0.0～0.5為中毒，2.0～3.0為強(qiáng)毒.

雞新城疫也可根據(jù)發(fā)病雞臨床癥狀或死亡情況分五種臨床類型.Doyle型或稱內(nèi)臟速發(fā)型死亡率高，主要病變?yōu)橄莱鲅?，可感染所有日齡的雞；Beach型也稱嗜神經(jīng)速發(fā)型，呈急性、致死性感染，臨床以神經(jīng)和呼吸道癥狀為主，各日齡雞均易感；Beaudette型為致病力弱的病毒株感染引起，僅致幼禽死亡；Hitchner型為緩發(fā)性病毒引起的隱性或輕微呼吸道感染病型；以及無癥狀腸型.新城疫病毒毒力差異是因?yàn)椴《驹趶?fù)制中，F(xiàn)蛋白及其前體糖蛋白（F0）被合成，F(xiàn)0被裂解分為F1和F2，出現(xiàn)了F蛋白的融合活性，使子代病毒具有傳染性，裂解作用由宿主細(xì)胞的蛋白酶介導(dǎo)[3].大量研究表明，F(xiàn)0裂解區(qū)域112～117aa氨基酸的變異與病毒的毒力強(qiáng)弱密切相關(guān)，裂解部位氨基酸序列最低要求是-113RXR/KR?F117[4-5].速發(fā)型和中發(fā)型毒株117位是苯丙氨酸，除113位和116位外，還有112位和115位兩個(gè)堿性氨基酸，能裂解強(qiáng)毒株F0蛋白的多個(gè)堿性氨基酸殘基位點(diǎn)的蛋白酶，廣泛存在于不同宿主組織器官的各類細(xì)胞中，速發(fā)型和中發(fā)型毒株能造成宿主致死性和全身性感染.緩發(fā)型毒株的117位為亮氨酸，113位為另一種堿性氨基酸，裂解這類毒株F0蛋白需要胰酶樣酶類，此酶只存在于呼吸道和消化道等少數(shù)種類的上皮細(xì)胞中，因此，這類病毒僅引起呼吸道和消化道的局部感染[4].2000年我國(guó)多地區(qū)報(bào)道了新城疫基因Ⅶ型的流行，導(dǎo)致抗體水平較高的產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降，引發(fā)抗體水平一般的幼齡雞和肉雞出現(xiàn)極高的發(fā)病率和死亡率，被認(rèn)為是新城疫第4次大流行的原因[6].分子分型研究證實(shí)，NDV有多個(gè)基因型和若干基因亞型，基于NDV F基因序列和F蛋白可變區(qū)氨基酸殘基變化等，將NDV分為 ClassⅠ和 ClassⅡ兩類[7].ClassⅠ的NDV為弱毒[8-10]；ClassⅡ被劃分成9個(gè)基因型[10]，當(dāng)前爆發(fā)流行者多為基因Ⅶ型，此外我國(guó)也存在基因Ⅷ、Ⅸ型的散發(fā)[10-13].

2 新城疫免疫途徑及影響雞新城疫免疫效果的因素分析

目前，雞新城疫的有效防控主要依靠免疫接種.常見的免疫途徑有氣霧、點(diǎn)眼、滴鼻、飲水、肌肉及頸部皮下注射等.氣霧免疫經(jīng)濟(jì)且方便，適宜規(guī)?；?、集約化的養(yǎng)雞生產(chǎn)，不影響母雞產(chǎn)蛋，但易引起雛雞呼吸道的并發(fā)癥，是國(guó)內(nèi)外研究較多的一種免疫方法.因呼吸道上皮細(xì)胞對(duì)新城疫病毒敏感性高，氣霧免疫時(shí)，病毒直接進(jìn)入呼吸道上皮細(xì)胞，在細(xì)胞中復(fù)制并形成持續(xù)性的免疫刺激，產(chǎn)生局部黏膜免疫的同時(shí)，刺激雞體產(chǎn)生體液免疫.飲水免疫適宜大群免疫，雞群中個(gè)體的疫苗攝入量有差異，易出現(xiàn)免疫不均，不適合初次免疫.滴鼻、點(diǎn)眼和注射免疫效果確實(shí)，但應(yīng)激大.尾家等學(xué)者發(fā)現(xiàn)滴鼻、點(diǎn)眼接種活疫苗后氣管黏膜出現(xiàn)了相當(dāng)于動(dòng)物IgA的免疫球蛋白.李肇增等用不同方式免疫接種試驗(yàn)雞，發(fā)現(xiàn)血凝抑制（HI）抗體有差異，肌注、皮下注射法血清HI抗體效價(jià)最高，滴眼法淚液的抗體效價(jià)最高，氣霧免疫法血清、淚液、氣管的HI抗體效價(jià)相似；氣霧免疫法較滴鼻法產(chǎn)生的HI抗體高，滴鼻法又較飲水法產(chǎn)生的抗體高且早.

影響新城疫免疫效果的因素眾多，如母源抗體、疫苗種類、免疫程序等，其中免疫程序是否合理是非常重要.目前國(guó)內(nèi)尚無可供統(tǒng)一使用的免疫程序.制定免疫程序的原則是既要保證雞群免疫后安全無疫病，又要盡量減少免疫接種次數(shù).雛雞免疫器官發(fā)育不完善，主要依靠母源抗體抵抗感染，母源抗體可使雛雞獲得對(duì)野毒感染的抵抗，但母源抗體會(huì)干擾新城疫活疫苗的免疫效果.雛雞從卵黃中獲得母源抗體，并將抗體傳給子代[14]，因此母雞的抗體與子代雛雞的母抗呈平行關(guān)系，出殼后的雛雞母源抗體峰值在第3～5天，隨后逐漸下降，半衰期為4.5天.大約6周雛雞的免疫器官成熟，免疫能力與成年雞相當(dāng).張友明認(rèn)為無野毒感染情況下，母雞免疫后的1～3個(gè)月，雛雞首免日齡應(yīng)在20天；門常平根據(jù)試驗(yàn)選定雛雞的母源抗體降至4log2為初免閾值，再次免疫時(shí)間應(yīng)根據(jù)雞群新城疫HI抗體水平而定，當(dāng)新城疫抗體水平的閾值為4log2時(shí)，需要再次進(jìn)行免疫；臨床實(shí)驗(yàn)中一些養(yǎng)雞場(chǎng)則將4～6log2定為再免閾值.1973年農(nóng)林部《獸醫(yī)生物藥品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》建議雞新城疫的免疫程序:出生雛雞Ⅱ系苗免疫，1個(gè)月后Ⅱ系苗二免，3～4個(gè)月再用Ⅰ系疫苗免疫1次增強(qiáng)免疫力.鑒于國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖格局的變更，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)辛朝安建議的雞新城疫免疫程序較為復(fù)雜:1日齡，克隆30或Ⅱ系或Ⅲ系或Ⅳ系弱毒苗點(diǎn)眼、滴鼻；10～15日齡，新城疫滅活油乳劑肌肉或皮下注射（0.3mL～0.5 mL/只），同時(shí)用克隆30或Ⅲ系或IV系弱毒疫苗點(diǎn)眼、滴鼻；25～30日齡，克隆30或Ⅲ系或Ⅳ系弱毒疫苗點(diǎn)眼、滴鼻；45～50日齡，Ⅳ系弱毒苗滴鼻、點(diǎn)眼或Ⅰ系疫中強(qiáng)毒活苗肌注；開產(chǎn)前1個(gè)月，雞新城疫油乳劑滅活苗肌肉或皮下注射；開產(chǎn)后，每1～2月用Ⅳ系弱毒疫苗噴霧或滴眼、滴鼻一次；開產(chǎn)中期42～45周齡，作為加強(qiáng)，肌肉或皮下注射油乳劑滅活苗.劉峰對(duì)使用不同新城疫免疫程序的免疫雞群感染NDV強(qiáng)毒，RT-PCR檢測(cè)NDV核酸表明:新城疫弱毒苗和油乳劑滅活苗同時(shí)接種，可使雞群對(duì)NDV強(qiáng)毒的感染率降至最低[15].

3 雞新城疫疫苗

疫苗免疫是新城疫綜合防制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，安全、高效的疫苗是新城疫有效防控的必要保證.臨床常用的新城疫疫苗主要有傳統(tǒng)的弱毒活苗、滅活疫苗，以及一些新型、正在研發(fā)和試驗(yàn)的疫苗，如DNA疫苗、活載體疫苗、基因工程苗、亞單位疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗等.

3.1 傳統(tǒng)新城疫疫苗

弱毒疫苗分緩發(fā)型毒株疫苗和中發(fā)型毒株疫苗兩種，是養(yǎng)雞場(chǎng)最常用的疫苗，這類疫苗可經(jīng)多途徑免疫，產(chǎn)生的免疫力較滅活苗快，但運(yùn)輸、保存要求條件較高，有散毒危險(xiǎn).Majiyagbe的試驗(yàn)表明，不論是否進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，B1株、LaSota株與 Ulster株相比，Ulster株免疫雞產(chǎn)生的抗體最低，LaSota株產(chǎn)生的抗體最高[16]，前者多用于雛雞首免，Bl、LaSota等毒株，通過滴鼻、點(diǎn)眼、氣霧等途徑免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生局部抗體，免疫后能快速保護(hù)免疫雞群，達(dá)到良好的免疫保護(hù)效果.對(duì)于中發(fā)型的疫苗如H株、Roakin株等雖免疫原性好且免疫持續(xù)期長(zhǎng)，但毒力較強(qiáng)，只能用于二免，臨床多用于2月齡以上雞群的加強(qiáng)免疫，此類疫苗被認(rèn)為有散毒和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，歐洲國(guó)家不使用.2002年李秀云用強(qiáng)毒分離株和強(qiáng)毒參考株F48E8攻擊LaSota疫苗免疫雞，免疫保護(hù)效果不理想，推測(cè)LaSota疫苗株與目前普遍發(fā)生、流行的APMV-Ⅰ毒株的基因型存在差異，不能有效控制家禽 APMV-Ⅰ感染.

新城疫滅活疫苗依據(jù)佐劑分油乳苗、蜂膠苗、鋁膠苗等，其免疫只能采用注射方式，免疫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，主要激發(fā)體液免疫，不排毒，無散毒危險(xiǎn)，疫苗更加安全，運(yùn)輸、保存方便.由于基因Ⅶ型毒株的致病性強(qiáng)大，汪明等在原新城疫疫苗基礎(chǔ)上，添加了流行基因型毒株，研制成了復(fù)合型新城疫蜂膠滅活苗，該疫苗能加速相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫，有效控制了新毒株的流行[17].

3.2 新型雞新城疫疫苗

20世紀(jì)中葉，當(dāng)經(jīng)典疫苗取得良好成果時(shí)，許多獸醫(yī)工作者繼續(xù)探索研究一些旨在克服傳統(tǒng)疫苗缺點(diǎn)的組分疫苗.新城疫病毒的F和HN蛋白與病毒的感染和致病能力有關(guān)，是刺激宿主產(chǎn)生免疫保護(hù)的主要抗原成分，能在痘苗病毒、皰疹病毒、火雞皰疹病毒等載體中獲得良好表達(dá)，其重組的病毒安全性好，接種雞能誘導(dǎo)抵抗新城疫強(qiáng)毒致死性攻擊的免疫保護(hù)力[18-19].1989年Sakaguchi等將NDV的F基因插入質(zhì)粒載體構(gòu)建DNA疫苗，免疫家禽9周后方能抵抗致死劑量同類強(qiáng)毒的攻擊[20].雖然DNA疫苗不易突變、返祖，安全性好，但疫苗免疫應(yīng)答不強(qiáng)，目的基因表達(dá)水平低，容易引起免疫耐受.

雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗，在試驗(yàn)階段已表現(xiàn)出具有良好的免疫效果.2001～2002丁壯等將NDV HN基因亞單位疫苗免疫試驗(yàn)雞后，用NDV強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率≥65%；王興龍等用 Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了NDV F蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較高滴度的抗 NDV F蛋白抗體；2003秦智鋒用重組菌pGHN/DE3生產(chǎn)的亞單位苗，也激發(fā)了免疫雞較高滴度的抗體.Mori等用昆蟲桿狀病毒作載體表達(dá)ND D26株的F基因，表達(dá)的F蛋白分泌到了細(xì)胞膜，其制備的亞單位苗，能抵抗NDV強(qiáng)毒的攻擊，但因成本高，難用于生產(chǎn).2000年李廣要等用天然磷脂脂質(zhì)體包裹NDV HN基因的真核表達(dá)質(zhì)粒peIJNM，免疫幼齡雛雞，7天后特異性抗體開始升高，免疫后6周用致死劑量的F48E9攻擊，免疫組存活率90%.2001～2003年我國(guó)多位學(xué)者進(jìn)行的NDV HN基因核酸疫苗的構(gòu)建和免疫保護(hù)性試驗(yàn)，皆取得了一定效果[21-23].2006年孟凡臣已成功將NDV F抗原基因，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入馬鈴薯葉片和莖段，獲得12株ND轉(zhuǎn)基因植物疫苗.有學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物疫苗是未來疫苗的發(fā)展方向之一[24].

4 新城疫檢測(cè)方法

4.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)

HA和HI是NDV檢測(cè)、抗體監(jiān)測(cè)最常用的血清學(xué)方法，用于監(jiān)測(cè)疫苗接種效力或檢測(cè)雞群感染雞新城疫的程度，特異性好、樣本用量少、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，用LaSota株制成濃縮抗原的HA和HI試驗(yàn)，效果令人滿意，常用以定性或定量NDV及其抗體滴度，但分離的NDV仍需測(cè)定MDT、ICPI和 IVPI確定毒力，或采用RT-PCR擴(kuò)增F基因結(jié)合測(cè)序確定分離株的毒力.

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

國(guó)內(nèi)、外學(xué)者建立的ELISA的間接法、雙抗體夾心法、捕獲法、競(jìng)爭(zhēng)法等試驗(yàn)方法相對(duì)于HA和HI試驗(yàn)，具有很高的敏感性，能定性及半微量、微量、超微量定量分析，樣本用量少、快速、通量高，但影響ELISA的因素較多，如反應(yīng)溫度和時(shí)間.

4.3 分子生物學(xué)技術(shù)

熒光定量RT-PCR（Real time RT-PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）在一個(gè)反應(yīng)管中完成反轉(zhuǎn)錄和PCR過程，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程或定量分析，直觀快速地觀察結(jié)果.基因芯片技術(shù)在普通 PCR基礎(chǔ)上，將核酸信息按要求固定在特定載體上制成基因芯片，進(jìn)行生物組信息平行性分析和檢測(cè)，從基因水平檢測(cè)NDV病毒核酸，特異、敏感、高通量.1992年Jarecki-Black設(shè)計(jì)的與NDV F基因5′端非編碼區(qū)互補(bǔ)的核苷酸探針，該探針能將弱毒株與強(qiáng)毒株和中毒株加以區(qū)分，應(yīng)用價(jià)值極高[25].但該方法易污染，儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)環(huán)境及操作人員的技術(shù)水平要求較高.

5 展望

新城疫的免疫防控取得了一定的成效，但多種病原的混合或/和繼發(fā)感染，雞群的免疫抑制問題等，要求養(yǎng)殖者除關(guān)注新城疫強(qiáng)毒或野毒感染外，對(duì)頻繁使用的活疫苗也要有足夠的認(rèn)識(shí)，高頻率、大劑量NDV活疫苗在機(jī)體中感染復(fù)制產(chǎn)生免疫應(yīng)答的同時(shí)，也可對(duì)雞呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生損害，如果與其他病原產(chǎn)生協(xié)同作用，則有可能促進(jìn)NDV疫苗病毒的大量增殖，造成嚴(yán)重的疫苗免疫反應(yīng).只有確定合理的免疫程序，運(yùn)用高效安全的疫苗，監(jiān)測(cè)新城疫抗體水平，才能有效防控雞新城疫.