王宇新 陳 晶

【提要】胰腺癌是二十一世紀(jì)人類面臨的高度惡性腫瘤之一，在我國占癌癥死亡原因的前10位。大多數(shù)患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去根治性手術(shù)時機，預(yù)后差，在近年來，影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展提高了胰腺癌的檢出率，但是對胰腺癌特別是微小胰腺癌診斷的特異性尚不盡人意。胰液的細胞學(xué)診斷曾被用于胰腺癌的診斷，但在細胞形態(tài)學(xué)上區(qū)分腫瘤細胞或炎癥細胞亦比較困難，其準(zhǔn)確性較低。胰腺癌惡性程度高，早期診斷困難，缺乏有效治療手段。因此，迫切需要深入探討胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，以尋找早期診斷和治療胰腺癌的新途徑。DNA甲基化在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中作用重要，進行胰腺癌DNA高甲基化基因的檢測將指導(dǎo)胰腺癌的診斷及靶向治療。

胰腺癌是最致命的癌癥之一，5年生存率不到10%。雖然胰腺癌只占所有癌癥病例的2%～3%，但它是世界第四大癌癥死亡的主要原因。在胰腺癌中，只有10%～20%的患者會接受治療，盡管做了手術(shù)，很多病人還是會復(fù)發(fā)。只有一小部分腫瘤切除的患者，5年生存率高達54%。不接受手術(shù)的病人的平均存活時間為確診后3到6個月[1]。胰腺癌的高死亡率主要是由于該病的惡性進展較為迅速和早期非特異性的癥狀，在疾病的早期患者可能沒有癥狀，并且腹痛、體重減輕和黃疸等癥狀與慢性胰腺炎的癥狀非常相似；慢性胰腺炎是胰腺癌的已知危險因素之一，另一個預(yù)后不良的重要原因是藥物抵抗，因此唯一的治療方法是及早發(fā)現(xiàn)疾病，并完全切除腫瘤[2]。目前，還沒有診斷胰腺癌的有效標(biāo)記。碳水化合物抗原19-9（CA-19-9）水平在胰腺癌中會升高，但通常僅在癌癥晚期，并且它在其他癌癥、慢性胰腺炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中也可以升高[3]。此外，復(fù)雜和先進的成像方式結(jié)合在一起，正電子發(fā)射斷層掃描等三相計算機斷層掃描、超聲內(nèi)鏡、腹腔鏡超聲檢查，內(nèi)鏡逆行胰膽管造影對胰腺癌的診斷也是必要的。這些方法中有一些是侵入性的，因此有可能出現(xiàn)并發(fā)癥[4]。所以，迫切需要一個微創(chuàng)的或非侵入性的胰腺癌標(biāo)記物。越來越多的證據(jù)顯示胰腺癌發(fā)病與多基因病變有關(guān)，這包括DNA序列變化引起的基因突變和非DNA序列變化引起的基因表達變異，后者指在細胞分裂過程中基因修飾對遺傳物質(zhì)表達的影響，并可通過細胞增殖向下遺傳，包括表現(xiàn)遺傳修飾等，其中最常見的分子機制有DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和RNA干擾等。

一、DNA甲基化

DNA甲基化包括在鳥苷上添加一個甲基（CH3）殘留物，被稱為CpG二核苷。這種修飾是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化的。CpG二核苷位于CpG-豐富的區(qū)域被稱為CpG島。人類基因組中60%啟動子區(qū)域的基因包含一個或更多的CpG島，在正常情況下，只有5%的啟動子序列被甲基化。在整個人類基因組中，大約50%到70%的核苷都被甲基化了，大多數(shù)甲基化的CpG二核都位于重復(fù)的基因組序列中[5]。有研究認為哺乳動物基因組只發(fā)生胞嘧啶甲基化[6]。CpG島甲基化可引起甲基化結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄抑制物組蛋白乙?；傅冉Y(jié)合到CpG島，阻斷轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到啟動子上，從而抑制基因表達。因此DNA甲基化可提供研究及治療腫瘤的新方向。人類許多惡性腫瘤在發(fā)生過程中都存在DNA甲基化紊亂，即胞嘧啶甲基化異常，主要可概括為癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基化，導(dǎo)致癌基因表達或活性增加，抑癌基因沉默或表達下調(diào)。在多種腫瘤發(fā)展相關(guān)的異常凋亡、自噬過程中同樣以相關(guān)基因的DNA甲基化修飾異常最為多見[7]。

二、DNA甲基化與胰腺癌的關(guān)系

異常的DNA甲基化（低甲基化和超甲基化）與癌癥發(fā)生密切相關(guān)，但是單個癌基因甲基化的規(guī)律及基因被激活和沉默的時機還尚不清楚[8]。重復(fù)序列的DNA低甲基化可能是早期致癌的一個主要原因，當(dāng)?shù)图谆l(fā)生在大部分基因時，會導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定；在啟動子序列中，DNA的超甲基化通常發(fā)生在CpG島，DNA超甲基化與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的過度表達有關(guān)，腫瘤抑制基因的啟動子區(qū)域的超甲基化導(dǎo)致腫瘤抑制功能的減弱或沉默。致癌基因啟動子區(qū)域的低甲基化作用可能導(dǎo)致此基因表達增加[9]。

癌細胞將細胞內(nèi)的DNA釋放到血液中并可以在血漿和血清中檢測到，這些DNA的異常甲基化可能是腫瘤所特有的，對胰腺癌的發(fā)展有潛在的幫助[10]。此外，異常的甲基化作用已經(jīng)在胰腺的癌前病變中表現(xiàn)出來，這表明啟動子甲基化參與了早期的癌變，隨著結(jié)構(gòu)異常的增加，甲基化程度也不斷增加，并且已經(jīng)證明，特定基因的異常甲基化可以作為判斷胰腺腫瘤進展的指標(biāo)[11]。

三、DNA甲基化與胰腺癌的診斷

在胰腺腫瘤形成過程中，基因甲基化異常有助于了解表觀遺傳學(xué)在腫瘤形成過程中所起的作用，并可作為腫瘤標(biāo)志物。胰腺癌的早期診斷非常困難，具有診斷價值的生物標(biāo)志物的檢測非常必要。

1.DNA甲基化與胰腺癌診斷的標(biāo)志物

BNC1是一種蛋白質(zhì)，在人類中由BNC1基因編碼，該基因位于15號染色體上。BNC1的信使RNA蛋白質(zhì)主要局限于表皮的基底細胞的細胞核、外根鞘和毛囊的基質(zhì)。這些區(qū)域被認為包含增殖細胞而缺乏特異的分化細胞。BNC1的表達是由P63引起的，它是一個具有不同亞型的轉(zhuǎn)錄因子，可同時作為致癌基因和腫瘤抑制基因[12-13]。BNC1蛋白質(zhì)擁有3對鋅指，可在人類核糖體RNA基因啟動子上產(chǎn)生3個DNase（脫氧核糖酶）-1足跡（結(jié)合位點）。BNC1被認為通過調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路作為RNA聚合酶1和RNA聚合酶2的轉(zhuǎn)錄因子。Shames[14]在2006年首次記述了BNC1的啟動子甲基化，主要在肺，乳腺，結(jié)腸和前列腺癌組織被頻繁發(fā)現(xiàn)，這表明BNC1甲基化可能是上皮癌的常見標(biāo)記。據(jù)研究所知，胰腺癌是唯一一個對BNC1啟動子甲基化進行分析并在血清中發(fā)現(xiàn)的癌癥[15]。

NPTX2是一種由位于7號染色體上的NPTX2基因編碼的突觸蛋白。NPTX2是正五聚蛋白家族的一部分，還包括c反應(yīng)蛋白。NPTX2廣泛分布在各組織:大腦、睪丸、胰腺、肝臟、心臟和骨骼肌。NPTX2參與了興奮性突觸的形成，并在帕金森病中被發(fā)現(xiàn)[16]。NPTX2的致癌作用還沒有完全被了解。然而，對胰腺癌細胞系的研究表明，NPTX2的表達明顯促進了g0/g1的抑制和細胞凋亡，并減少了細胞增殖、遷移和入侵，這表明NPTX2在胰腺癌的形成中起到了腫瘤抑制基因的作用。NPTX2的啟動子超甲基化在胰腺癌組織中被發(fā)現(xiàn)，甚至在癌前病變（PanIN）中，也已經(jīng)被證實NPTX2啟動子的甲基化作用隨著異常增生程度的增加而增加；與正常的胰腺組織或相鄰的正常組織相比，NPTX2信使RNA的表達在胰腺癌細胞系和胰腺癌組織中較低。正常胰腺組織中NPTX2基因的啟動子區(qū)域大部分都是未甲基化的，5-aza-dc的作用使NPTX2基因啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致了NPTX2信使RNA的表達，這表明啟動子區(qū)高甲基化是NPTX2信使RNA表達下調(diào)的主要原因，是胰腺癌早期腫瘤發(fā)生的環(huán)節(jié)之一[17]。在一些細胞系中，加用組蛋白脫乙酰酶治療可以進一步增強NPTX2信使RNA表達，表明NPTX2信使RNA的表達下調(diào)不僅可以由啟動子區(qū)超甲基化，還可以由一個復(fù)雜的表觀遺傳變化引起。在胰腺癌患者的胰腺液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了NPTX2的超甲基化。與ADAMTS1和BNC1一樣，NPTX2的啟動子超甲基化已經(jīng)被研究可作為胰腺癌一種血液標(biāo)記[18]。

ppENK是一種蛋白質(zhì)編碼基因。從前體蛋白原基素（PENK）烯酮和其他肽類物質(zhì)，如神經(jīng)遞質(zhì)、自分泌和旁分泌因子中產(chǎn)生的，作用于與阿片受體密切相關(guān)的配體，通過增加局部缺血的耐受性，其具有心血管保護功能。ppENK信使RNA在許多組織中都很豐富[19]。據(jù)研究所知，其異常的啟動子超甲基化只與胰腺癌有關(guān)。ppENK高甲基化已經(jīng)在癌前病變、皮內(nèi)乳頭狀瘤（IPMNs）、PanIN中被發(fā)現(xiàn)，而且在 IPMNs病人手術(shù)或內(nèi)鏡中收集的胰腺液中被檢測到。惡性度高的IPMNs比惡性度低的IPMNs組織中（82%和28%）甲基化更加頻繁，并且DNA的高甲基化與ppENK信使RNA表達的丟失有關(guān)。同樣地，惡性度高的PanINs中ppENK的高甲基化更常見，這表明ppENK高甲基化能促進癌前病變的發(fā)展和進展。ppENK的高甲基化也在胰腺癌組織樣本和胰腺癌患者的胰腺液中被檢測到，并且正常的胰腺組織中ppENK基因未甲基化并顯示正常的ppENK信使RNA表達，然而，在慢性胰腺炎和健康個體的胰液中也發(fā)現(xiàn)一些ppENK高甲基化。胰腺癌細胞系已被證實具有ppENK的高甲基化和ppENK信使RNA的不表達。通過應(yīng)用甲基化劑5-aza-dc對胰腺癌細胞株的治療逆轉(zhuǎn)了ppENK信使RNA的表達，并減少了在G1期細胞的增殖和增加，這說明ppENK啟動子的甲基化作用在某種程度上促進了胰腺癌的形成[8]。

p16[細胞依賴性激酶抑制劑 2A（CDKN2A）]是一種由CDKN2A/P16基因編碼的腫瘤抑制蛋白，該基因位于9號染色體上。p16蛋白質(zhì)具有腫瘤抑制功能，在調(diào)節(jié)細胞周期中起著重要作用，它與CDK4-CDK6相結(jié)合，導(dǎo)致了G1期細胞周期的停止。在不同類型的癌癥組織（如胰腺癌、胃癌、白血病、食道癌、鼻咽癌、RCC、CRC、非小細胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等）中均發(fā)現(xiàn)p16的超甲基化，甚至在各種癌癥患者的血清和血漿中也觀察到。在胰腺癌患者的血漿中，p16的啟動子高甲基化已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[20]。

2.在胰腺癌中DNA甲基化的臨床應(yīng)用

大量研究表明，在所有的表觀遺傳變異中，DNA異常甲基化抑制了特定腫瘤抑制基因的啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因沉默或激活，這種基因組的不穩(wěn)定性造成染色體的丟失。廣泛的證據(jù)表明，DNA甲基化在胰腺癌的發(fā)展和進展中起著關(guān)鍵的作用，但是，在胰腺腫瘤中甲基化的臨床應(yīng)用是有限的。DNA超甲基化在胰腺癌早期即發(fā)生，所以DNA甲基化程度的測試可以用于早期癌癥的分子檢測[21-23]。有家族病史或癌前病變例如IPMN的患者可看作是胰腺癌發(fā)生的高危患者。由于缺乏有效的篩選試驗，而且外科手術(shù)切除也與發(fā)病率有顯著的關(guān)聯(lián)，所以這些病人的臨床治療極具挑戰(zhàn)。因此，迫切需要一個能對這些患者的風(fēng)險分層進行評估的分子診斷試驗，臨床實驗已經(jīng)評估了甲基化定量試驗的作用，例如甲基化特異PCR（MSP）在對有家族病史的胰腺癌患者的診斷。這些試驗主要是對胰液進行評估，它的特異性和敏感性還沒有被證實。然而，隨著檢測甲基化的技術(shù)的改進，這些測試有可能取代目前的篩選模式。DNA甲基化是癌癥的一種預(yù)兆，所以它可以用于癌前病變和惡性疾病的危險分層，也可以作為一個評估癌癥風(fēng)險的工具[24-26]。

3.DNA甲基化與胰腺癌的治療

目標(biāo)甲基化可以逆轉(zhuǎn)抑制基因表達。藥物如5-氮雜胞苷和5-aza-2-脫氧胞苷（地西他濱）或天然產(chǎn)物如燃料木黃酮或姜黃素可以通過抑制DNMT影響DNA甲基化，另外，伴侶蛋白如熱休克蛋白（Hsp90）可以通過抑制DNMT的轉(zhuǎn)運或者反義DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA干擾 （RNAi）通過抑制DNMT的轉(zhuǎn)錄來影響DNA甲基化[27]。在臨床前模型中證實，對DNA甲基化的抑制可以導(dǎo)致像富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白（SPARC）這樣的抑制基因的表達，SPARC的表達可以抑制腫瘤生長，改變化療藥物的敏感性[28]。這些治療策略在臨床前期是很有發(fā)展的，但是他們在臨床上的應(yīng)用是有限的，他們的潛在用途包括預(yù)防使用天然化合物或與放療、化療或其他靶向制劑結(jié)合使用。

四、結(jié)論

DNA甲基化對胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展均起著重要作用。隨著對DNA甲基化的進一步研究，對胰腺癌的發(fā)生機制也會有更深入的了解，為胰腺癌的早期診斷、預(yù)測復(fù)發(fā)、評估預(yù)后及靶向治療等方面提供了新的方法和途徑，其未來的研究前景必將更加廣闊。