賈 昊 劉云鵬 屈欣怡 劉仲偉 姜 馨

1.SERCA2a生物學(xué)特性及病理生理學(xué)作用

SERCA是一種分子量為110 kDa的跨膜蛋白，屬于P型ATP酶家族，可以分為3個(gè)不同區(qū)域的跨膜蛋白，包括胞漿區(qū)、跨膜螺旋和管腔袢，并且有10多種不同的細(xì)胞亞型在不同組織中表達(dá)。在心臟，其主要表達(dá)為SERCA2a，它能夠利用ATP水解得到的化學(xué)能源運(yùn)輸2個(gè)Ca2+離子進(jìn)入肌漿網(wǎng)內(nèi)。SERCA2a的活性取決于SERCA2a蛋白的含量，并進(jìn)一步受其抑制蛋白受磷蛋白(phospholamban，PLB)、肌脂蛋白(Sarcolipin，SLN)的調(diào)控[1]。SERCA2a是心臟收縮舒張調(diào)節(jié)的主要決定因素，已被證實(shí)降低該蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心臟收縮、舒張功能障礙。

SERCA2a對(duì)于維持鈣穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)心肌細(xì)胞正?；顒?dòng)是非常重要的。心肌細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣吸收不足，意味著細(xì)胞收縮可用的鈣量減少，最終導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能受損。在許多心血管疾病如糖尿病心肌病、心力衰竭中發(fā)現(xiàn)這一鈣穩(wěn)態(tài)失衡，潛在的機(jī)制可能是由于多種因素導(dǎo)致的SERCA2a mRNA、SERCA2a蛋白的表達(dá)或活性降低。眾多研究表明在糖尿病心肌病大鼠中SERCA2a的表達(dá)明顯下調(diào)，鈣攝取量明顯減少[2]。同時(shí)，鈣超載可誘發(fā)心律失常，致使SERCA2a活性降低，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平升高，最終導(dǎo)致鈉鈣離子交換體蛋白(Na+/Ca2+exchanger,NCX)表達(dá)增加，這將使阿諾堿受體(ryanodine receptor，RyR)開放進(jìn)一步增加，在心臟舒張期增加鈣漏，誘發(fā)后除極和觸發(fā)活動(dòng)，進(jìn)而引起室性心律失常。Wang等對(duì)心力衰竭動(dòng)物模型的研究顯示，在肥大的心肌細(xì)胞中，PAK1缺陷增加了快速心律失常的易感性，進(jìn)一步研究得知，PAK1通過調(diào)整SERCA2a的活性來維持鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞電生理穩(wěn)定[3]。隨著SERCA2a活性的下降，心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高，其電穩(wěn)定性下降，從而易于發(fā)生室性心律失常。最近的研究也表明，SERCA2a基因治療可以改善心臟收縮功能并且恢復(fù)細(xì)胞電生理穩(wěn)定性，從而起到抗心律失常的作用?？傊?，在糖尿病心肌病等心血管疾病中，SERCA2a活性降低是導(dǎo)致糖尿病心肌病患者心功能障礙、心律失常的重要原因之一。

2.PLB、SLN對(duì)SERCA2a的調(diào)控

(1)PLB對(duì)SERCA2a的調(diào)控 PLB 是由52個(gè)氨基酸組成，位于心臟肌漿網(wǎng)上。PLB在身體各組織中表達(dá)含量不同。例如，PLB在小鼠心室組織比心房組織表達(dá)高3倍以上，在心臟活動(dòng)的各個(gè)時(shí)期中需要對(duì)Ca2+進(jìn)行不同的調(diào)節(jié)。這在人類心臟組織中也得到了證實(shí)，PLB蛋白在右心房組織較右心室減少44%，其去磷酸化作用抑制SERCA2a的活性。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度低時(shí)，PLB干擾SERCA2a，減弱SERCA泵對(duì)Ca2+的表觀親和力。當(dāng)Ca2+濃度增高時(shí)，由于Ca2+的激活，這種抑制作用得到緩解。PLB受到鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的調(diào)控。CaMKII是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在SERCA2a的蘇氨酸[17]殘基上活化使PLB磷酸化。另一個(gè)PLB調(diào)控機(jī)制是PKA的激活。PKA激活是在SERCA2a的絲氨酸[16]殘基上將PLB磷酸化，進(jìn)而緩解對(duì)SERCA2a抑制，提高心肌收縮和舒張的速度。通過PKA或CAMKII途徑使PLB磷酸化可使SERCA2a活性提高2～3倍[4]，這將有利于增加心肌舒張速度。因此，增加總PLB蛋白質(zhì)含量或PLB磷酸化是調(diào)節(jié)心臟SERCA2a活性的途徑之一。

(2)SLN對(duì)SERCA2a的調(diào)控 SLN與PLB同屬一蛋白家族，其作用與PLB類似，具有一個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，通過直接結(jié)合或與PLB形成二聚體后結(jié)合SERCA2a，調(diào)節(jié)鈣離子敏感性。SLN在心房組織中高表達(dá)，心室只有少量表達(dá)。在結(jié)構(gòu)上，SLN是一個(gè)具有31個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其抑制心臟SERCA2a的活性，可能通過降低泵的表觀親和力導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。Babu等用腺病毒將SLN基因轉(zhuǎn)染到大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬態(tài)幅度降低，SLN對(duì)SERCA2a功能的抑制作用減少了31%，證實(shí)其可以減緩心肌細(xì)胞舒張作用[5]。類似于PLB，SLN在SERCA2a的蘇氨酸5殘基上將絲氨酸/蘇氨酸激酶16(STK16)磷酸化，促進(jìn)SLN 與SERCA2a解離[6]。Babu等進(jìn)一步研究得知，從PLB-/-轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在給予異丙腎上腺素后，SLN的抑制作用得到緩解[5]，這也就是說，激動(dòng)β腎上腺素能受體，可使SLN與SERCA2a解離，增強(qiáng)SERCA2a活性，促進(jìn)心肌收縮。在心血管疾病中也已證實(shí)，SLN表達(dá)失調(diào)。比如，在二尖瓣關(guān)閉不全手術(shù)患者的左心室組織中，SLN mRNA和蛋白水平高出12-16倍[1]。綜上可以得出，SLN負(fù)性調(diào)節(jié)SERCA2a活性，進(jìn)而影響心功能。

3.翻譯后修飾、轉(zhuǎn)錄因子對(duì)肌漿網(wǎng)鈣泵的表達(dá)與調(diào)控

(1)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)SERCA2a的影響 編碼人類SERCA基因的是ATP2A2，位于染色體區(qū)12q23-q24.1[1]，其包括22個(gè)外顯子。ATP2A2基因選擇性剪接可以轉(zhuǎn)錄成不同的蛋白異構(gòu)體，SERCA2a，SERCA2b和SERCA2c。有幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到ATP2A2 啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，分別是線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)、B2(TFB2M)和轉(zhuǎn)錄因子Sp1。在生理情況下，已被證實(shí)ATP2A2可調(diào)節(jié)心臟SERCA2a基因轉(zhuǎn)錄，分別結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)-114bp至122bp 和-122bp至-117bp[7]。過度表達(dá)TFAM和TFB2M已被證明增加其轉(zhuǎn)錄活性的2倍。在病理情況下，特別是在糖尿病心肌病、心肌梗死和心力衰竭中，TFAM表達(dá)下調(diào)。因此，轉(zhuǎn)錄因子TFAM和TFB2M是調(diào)節(jié)ATP2A2基因轉(zhuǎn)錄過程中必不可少的影響因素之一。

另一種轉(zhuǎn)錄因子Sp1也可調(diào)節(jié)ATP2A2基因轉(zhuǎn)錄。Sp1對(duì)于心肌特異性轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)已被證明在SERCA2a基因近端 (-284～-80 bp)啟動(dòng)子區(qū)。然而，Sp1調(diào)節(jié)ATP2A2基因轉(zhuǎn)錄的確切作用尚不十分明確，但SP1介導(dǎo)的ATP2A2基因轉(zhuǎn)錄可能是SERCA2a在糖尿病心肌病中下調(diào)的原因之一。因此，上述轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)，解釋了糖尿病心肌病中SERCA2a活性降低的機(jī)制。

(2)翻譯后修飾對(duì)SERCA2a的影響 內(nèi)源性蛋白PLB和SLN磷酸化間接調(diào)節(jié)SERCA2a活性，同時(shí)一些翻譯后修飾直接調(diào)節(jié)SERCA2a蛋白。這些翻譯后修飾包括糖基化修飾、硝化和泛素化，可以直接調(diào)節(jié)SERCA2a蛋白[1]。

糖基化是一種翻譯后修飾，發(fā)生在糖附著到SERCA2a蛋白上。糖基化已被證明降低SERCA2a活性，從而降低心肌收縮后Ca2+的回?cái)z。糖基化水平增加，SERCA2a mRNA和蛋白水平減少25%～47%，同時(shí)PLB蛋白水平增加40%[8]。氧連接的氮乙酰葡萄糖胺修飾(O-GlcNAc)，是一種特殊形式的糖基化，它能減弱SERCA2a蛋白水平，進(jìn)而影響Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)。Bennett等研究顯示，在糖尿病條件下O-GlcNAc水平增加，而SERCA2a蛋白水平下降25%-47%，這將延長43%新生大鼠心肌細(xì)胞Ca2+舒張[9]，這一數(shù)據(jù)表明，O-GlcNAc調(diào)節(jié)心肌SERCA2a表達(dá)。除了SERCA2a蛋白水平改變，O-GlcNAc還可以通過調(diào)節(jié)PLB磷酸化修飾SERCA2a活性。通過腺病毒轉(zhuǎn)染O-GlycNAc酶使細(xì)胞O-GlcNAc表達(dá)減少，發(fā)現(xiàn)PLB總蛋白含量減少50%，同時(shí)PLB磷酸化增加了2倍[9]。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，糖基化修飾通過直接影響SERCA2a或誘導(dǎo)PLB磷酸化，從而影響心臟的SERCA2a修飾調(diào)節(jié)[10]。

硝化亦被證實(shí)在人類心力衰竭中表達(dá)增加。此外，在擴(kuò)張性心肌病中SERCA2a硝化水平升高約2倍左右；用高葡萄糖灌注大鼠心臟與正常血糖水平比較，SERCA2a的硝基酪氨酸水平幾乎翻了一倍。Lokuta等進(jìn)一步研究證實(shí)SERCA2a蛋白硝化是通過多元醇通路，主要因?yàn)楦哐菞l件下引起的氧化應(yīng)激所致[11]。

SERCA2a泛素化目前還在研究中。泛素化修飾SERCA2a主要通過1型小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-likemodifier，SUMO1)，結(jié)合在SERCA2a 賴氨酸480和賴氨酸585殘基。當(dāng)心臟衰竭時(shí)，總SUMO1減少30%～40%，相應(yīng)的SERCA2a泛素化也減少[12]。而在壓力超負(fù)荷心臟組織中注射 SUMO1可提高心功能及SERCA2a活性。這些數(shù)據(jù)表明泛素化可能對(duì)心臟起保護(hù)作用。Kho等研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SUMO1導(dǎo)致SERCA2a蛋白水平降低40%[13]。SERCA2a泛素化可以提高SERCA2a功能的具體機(jī)制仍尚未完全闡明，可能通過阻斷其他的翻譯后修飾，比如：乙?；饔没蛱岣逜TP酶的活性來提高SERCA2a的功能。

4.糖尿病心肌病中肌漿網(wǎng)鈣泵的表達(dá)與調(diào)控

(1)高血糖對(duì)SERCA2a影響 高血糖最終引起心臟病理變化為心肌肥厚、纖維化、心臟自主神經(jīng)病變和心功能、結(jié)構(gòu)的改變[14]?；谶@些病理改變，發(fā)現(xiàn)在糖尿病心臟組織中SERCA2a下調(diào)。然而，這種下調(diào)的分子機(jī)制是不明確的。高血糖是糖尿病并發(fā)癥進(jìn)展的主要因素，其引起的心肌功能障礙包括直接葡萄糖毒性、擾亂能量代謝和細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的多元醇活化，糖化蛋白質(zhì)導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物AGEs(advanced glycationend products, AGEs)的形成可能通過調(diào)控SERCA2a活性，最終導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[14]。

對(duì)于糖尿病引起的SERCA2a表達(dá)下調(diào)，Bidasee等首次提出在慢性糖尿病中，AGEs在SERCA2a上形成，致使SERCA2a活性降低[8]。用鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠(8周)的心臟組織，顯示出較低水平SERCA2a和較高水平的PLB，并且發(fā)現(xiàn)AGEs與SERCA2a交聯(lián)。此外，高血糖使ROS(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多，激活A(yù)DP-核糖聚合酶1，這種酶抑制甘油醛3-磷酸脫氫酶，導(dǎo)致糖酵解中間體積累，AGEs生成，進(jìn)而使SERCA2a糖基化。研究還顯示，糖尿病大鼠(6周)開始使用胰島素治療2周后不僅可以顯著改善心功能，并且還可以防止AGEs在SERCA2a上形成交聯(lián)。除了SERCA2a的表達(dá)減少外，PLB的增加和SERCA2a-PLB比例降低，心臟舒張間期延長也可能是由于AGEs形成[8]。

多元醇途徑可能通過增加氧化應(yīng)激而損害SERCA2a活性[15]。正常血糖水平時(shí)，由于醛糖還原酶(aldose reductase,AR)，即多元醇途徑的限速酶，對(duì)葡萄糖具有非常高的K m，因此該代謝途徑不是非?；钴S的。然而，在高血糖時(shí)，AR將葡萄糖還原為山梨醇，同時(shí)其輔助因子NADPH被氧化形成NADP。然后將山梨糖醇通過山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)轉(zhuǎn)化為果糖，伴隨NAD+還原為NADH[16]。NADPH的降低導(dǎo)致還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)水平降低，因?yàn)镹ADPH是谷胱甘肽還原酶再生為GSH的輔酶。另一方面，NADH水平升高會(huì)增加超氧化物的含量，因此，在高血糖時(shí)，通過激活多元醇途徑降低抗氧化防御，并且增加活性氧(ROS)水平，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。以前的研究結(jié)果表明，糖尿病小鼠心臟AR的活性升高，AR抑制劑治療改善了糖尿病大鼠心臟乳頭肌的收縮能力，但機(jī)制尚不明確。Tang等研究發(fā)現(xiàn)多元醇途徑通過降低SERCA2的活性，致使急性高葡萄糖誘導(dǎo)的心臟收縮功能障礙[15]。在急性高血糖心臟中，由于SDH將山梨糖醇氧化成果糖，多元醇途徑的活化增加了NADH / NAD+的比例。增加的NADH刺激NADH氧化酶，以產(chǎn)生ROS。ROS通過氧化半胱氨酸硫醇來抑制SERCA2a，干擾ATP結(jié)合位點(diǎn)，使其不能水解ATP[17]。Tang等研究還表明，高糖灌注導(dǎo)致SERCA2a的硝化增加、SERCAC674-SO3H水平升高，此外，將AR抑制劑或SDH抑制劑添加到高葡萄糖灌注液中降低了SERC2a硝化和SERCAC674-SO3H的水平，這些證據(jù)表明SERCA2a活性的降低是由于高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的?？傊?，多元醇途徑是高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的主要原因。

(2)胰島素抵抗對(duì)SERCA2a影響 2型糖尿病心肌細(xì)胞中SERCA2a的病理生理變化尚不完全清楚。飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠表現(xiàn)出SERCA2a活性降低，心肌功能障礙。然而，這并沒有影響NCX功能，也沒有影響SERCA2a蛋白、PLB或NCX含量[14]。最近的一項(xiàng)研究顯示，給予2型糖尿病大鼠胰島素治療，早期SERCA2a / PLB比值升高，心肌細(xì)胞舒張速度增快，說明胰島素直接刺激心肌細(xì)胞SERCA2a表達(dá)[16]。這也就是說，胰島素和SERCA2a在2型糖尿病心臟收縮舒張過程中的重要作用。這個(gè)研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，胰島素可誘導(dǎo)Akt(v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene)磷酸化，表明給予胰島素治療后SERCA2a水平升高可能通過PI3-kinase-Akt-SERCA2a 信號(hào)通路[18-19]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也起到重要作用。Takada等用OLETF(自發(fā)2型糖尿病)大鼠模型，培養(yǎng)25-30周，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和GRP94水平增加，而SERCA2a蛋白(但不是mRNA)減少(35%)[20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與無糖尿病大鼠(LETO)相比，SERCA2a泛素化水平升高，證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)SERCA2a泛素化增強(qiáng)，致使SERCA2a蛋白的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而引起心臟舒張功能不全。但是，眾多研究表明糖尿病大鼠中SERCA2a mRNA水平減少，而以上研究模型卻沒有。對(duì)這一研究結(jié)果一個(gè)合理的解釋是，在SERCA2a基因轉(zhuǎn)錄降低之前，SERCA2a蛋白減少可能通過一些非轉(zhuǎn)錄機(jī)制，比如上述提到的翻譯后修飾，使SERCA2a降低，并且SERCA2a基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致SERCA2a mRNA降低是糖尿病晚期事件。總之，在2型糖尿病中，胰島素通過直接刺激SERCA2a、胰島素抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控SERCA2a蛋白的表達(dá)。

5.小結(jié)與展望 眾多實(shí)驗(yàn)表明，SERCA2a在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。高糖、胰島素抵抗引起的心臟收縮舒張功能障礙可能與多元醇的活化，AGEs的形成，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增加有關(guān)，上述因素通過降低SERCA2a活性或SERCA2a蛋白含量，導(dǎo)致SR鈣回?cái)z減少，引起心肌舒張速度降低。此外，轉(zhuǎn)錄因子TFAM、TFB2M、SP1均可結(jié)合到ATP2A2 啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)節(jié)SERCA2a轉(zhuǎn)錄活性，非轉(zhuǎn)錄途徑通過幾種翻譯后修飾對(duì)SERCA2a蛋白調(diào)控，致使SERCA2a活性下降。我們?nèi)圆恢朗欠裼衅渌緩絽⑴cSERCA2a的調(diào)控，對(duì)于糖尿病心肌病中SERCA2a表達(dá)與調(diào)控仍需進(jìn)行更深層次的探索。SERCA2a表達(dá)與調(diào)控可能是糖尿病心肌病心力衰竭防治新的靶點(diǎn)。