趙小峰， 吳桂梅， 金 磊， 汪 瑤， 顏景芝

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)國家級基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，江蘇徐州 221004；2.江蘇省腦病生物信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/徐州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心，江蘇徐州 221004)

海人藻酸受體(kainate receptors，簡稱KARs)是屬于離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors，簡稱iGluRs)的一類受體，通過與谷氨酸結(jié)合來介導(dǎo)中樞神經(jīng)元的快興奮性傳導(dǎo)，參與突觸傳遞、神經(jīng)調(diào)節(jié)等神經(jīng)活動，與腦功能障礙、神經(jīng)退行性疾病(癲癇、孤獨(dú)癥、精神分裂癥等)有密切關(guān)系[1]。神經(jīng)纖毛和特羅德樣蛋白質(zhì)(neuropilin and tolliod-like proteins，簡稱Neto)是篩選視網(wǎng)膜功能基因時發(fā)現(xiàn)的1種Ⅰ型跨膜蛋白質(zhì)[2]，包括Neto1和Neto2 2種類型。研究表明，Neto1和Neto2是海人藻酸受體僅有的2個輔助亞基[3-4]，Neto蛋白質(zhì)在大腦中分布廣泛，可通過與KARs的不同亞基結(jié)合，調(diào)節(jié)KARs在突觸中的定位和生理特性，進(jìn)而影響受體通道的脫敏作用及突觸轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。但Neto蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)KARs的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、作用機(jī)制還不清楚。本研究利用生物信息學(xué)工具對家兔Neto2蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測與研究，旨在為進(jìn)一步研究家兔Neto2蛋白質(zhì)在生理和病理?xiàng)l件下的作用及其對KARs功能調(diào)控機(jī)制提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從GeneBank獲得家兔和其他物種Neto2蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在線分析工具為Blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)、BepiPred(http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)、ExPASy(http：//ca.expasy.org)、DTU Bioinformatics(http：//www.cbs.dtu.dk)。

1.2 方法

利用生物信息學(xué)在線工具研究家兔Neto2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(http：//web.expasy.org/protparam/)、疏水性(http：//web.expasy.org/protscale)、二級結(jié)構(gòu)(http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman/)、跨膜結(jié)構(gòu)域(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、信號肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、亞細(xì)胞定位(http：//www.genscript.com/psort.html)、三級結(jié)構(gòu)(https：//swissmodel.expasy.org/)、功能基序(http：//smart.embl-heidelberg.de)、糖基化位點(diǎn)(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)、磷酸化位點(diǎn)(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，最后使用MEGA6.05軟件和String工具研究Neto2蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化關(guān)系、相互作用的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)

家兔Neto2分子式為C2 608H4 049N703O777S33，含518個氨基酸殘基，由20種基本氨基酸組成，氨基酸殘基數(shù)、含量見表1。家兔Neto2蛋白質(zhì)分子量為58 742.06 u，等電點(diǎn)為 6.34，含帶正電荷的氨基酸殘基(賴氨酸+精氨酸)60個，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(谷氨酸+天冬氨酸)64個。在體外，家兔Neto2的半衰期在哺乳動物細(xì)胞中為30 h，在酵母 中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為 43.62，根據(jù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定參數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，推測家兔Neto2蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)[5]。脂溶系數(shù)為73.78，總平均親水系數(shù)(grand average of hydropathi city，簡稱GRAVY)為-0.329，說明該蛋白質(zhì)為親水蛋白質(zhì)[6](正值為疏水性，負(fù)值為親水性，介于-0.5～0.5之間主要為兩性蛋白質(zhì))。這與ProtScale軟件分析的結(jié)果(圖1)一致，圖中顯示，大部分氨基酸分值為較低的負(fù)值，表明這些氨基酸具有較強(qiáng)的親水性。

2.2 二級結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)入二級結(jié)構(gòu)在線分析工具，選擇參數(shù)：窗口參數(shù)(windowwidth)為17，相似度(similarity threshold)為8，狀態(tài)數(shù)(number of states)為4，由圖2可知，家兔Neto2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占30.69%(159個氨基酸殘基)，延伸鏈占19.88%(103個氨基酸殘基)，β-轉(zhuǎn)角占4.25%(22個氨基酸殘基)，無規(guī)則卷曲占45.17%(234個氨基酸殘基)。

表1 家兔Neto2的氨基酸組成

2.3 信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SignalP 4.1對家兔Neto2蛋白質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，第23位氨基酸的最高原始剪切位點(diǎn)得分是0.490，同時該位點(diǎn)綜合剪切分值最高，為0.655，第16個氨基酸信號肽的得分最高，0.942，第1～22個氨基酸信號肽的平均得分為 0.774，趨向于+1，表明家兔Neto2蛋白質(zhì)存在信號肽(界限值為0.45)，最可能的切割位點(diǎn)在22和23氨基酸殘基(VEG-IA)之間(圖3)。經(jīng)分析家兔Neto2蛋白質(zhì)存在跨膜結(jié)構(gòu)，1～338位于膜外，339～361為跨膜區(qū)，362～518位于膜內(nèi)(圖4)。

2.4 糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析

經(jīng)NetOGlyc 4.0分析，家兔Neto2蛋白質(zhì)存在糖基化位點(diǎn)，分別是第184、284位的絲氨酸殘基和291位的蘇氨酸殘基，得分依次為0.658 779、0.683 538和0.522 623。對家兔Neto2蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，有62個磷酸化位點(diǎn)(得分>0.5)(圖5)，其中絲氨酸36個，蘇氨酸16個，酪氨酸10個。推測不同的位點(diǎn)可被不同的激酶引發(fā)磷酸化。

2.5 功能結(jié)構(gòu)分析

使用GORⅣ、SMART對家兔Neto2蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果(圖6)表明，該蛋白質(zhì)含2個CUB和1個LDLa保守結(jié)構(gòu)域，2個CUB位于45～159、177～292位氨基酸殘基處，LDLa位于296～333位氨基酸殘基處。C端含有1個復(fù)合螺旋區(qū)(coiled coil regions，綠色方形區(qū))(404～432位氨基酸殘基處)，在N端(3～27位氨基酸殘基處)還有1個低復(fù)雜性區(qū)域，此外在346～368位氨基酸殘基處為跨膜區(qū)域(藍(lán)色方形區(qū))。

2.6 亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，家兔Neto 2蛋白質(zhì)主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(44.4%)、線粒體(44.4%)中，細(xì)胞核(11.1%)中也有少量分布。Neto2蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體中定位較多，說明蛋白質(zhì)主要發(fā)揮受體、運(yùn)輸及結(jié)合的作用[7]。

2.7 三級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)相互作用分析

采用同源建模法預(yù)測家兔Neto2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，第42～237位氨基酸殘基參與建模，模板為3kq4.1.B Cubilin。由圖7可知，在三級結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)無規(guī)卷曲、折疊延伸鏈分布較多，而α-螺旋分布較少，這與二級結(jié)構(gòu)中預(yù)測的結(jié)構(gòu)元件分布大致相同。

String數(shù)據(jù)庫是搜索已知蛋白質(zhì)之間及與預(yù)測未知蛋白質(zhì)之間相互作用的在線工具。這種作用包括蛋白質(zhì)之間直接的物理相互作用及蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性。本研究采用String數(shù)據(jù)庫對家兔Neto2蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，簡稱PPI)分析，若關(guān)聯(lián)系數(shù)>0.4，則認(rèn)為相互作用顯著[8]。通過String在線搜索發(fā)現(xiàn)，一些與家兔Neto2相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)包括氨基末端鈣結(jié)合蛋白質(zhì)1(n-terminal EF-hand calcium binding protein 1，簡稱Necab1)、氨基末端鈣結(jié)合蛋白質(zhì)2(Necab2)、與酪氨酸磷酸化生長因子相關(guān)的銜接蛋白質(zhì)NCK1、SH2結(jié)構(gòu)域連接蛋白質(zhì)1(SHC binding and spindle associated 1，簡稱SHCBP1)、谷氨酸鹽受體海人藻酸5(glutamate receptor ionotropic kainate 5，簡稱Grik5)、甲硫氨酰-tRNA合成酶2(methionyl-tRNA synthetase 2，簡稱MARS2)、二甲基甘氨酸脫氫酶前體(dimethylglycine dehydrogenase precursor，簡稱Dmgdh)、肌氨酸脫氫酶(sarcosine dehydrogenase，簡稱SARDH)、乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase 2，簡稱ACSS2)等，由圖8可知，家兔Neto2蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)谷氨酸受體活性、β-淀粉樣蛋白質(zhì)(Aβ)生成及神經(jīng)細(xì)胞的記憶調(diào)節(jié)等活動。

2.8 蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA6.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖9可知，嚙齒目的小家鼠、褐家鼠、黃金倉鼠聚為一類，再與兔形目的家兔相聚類。靈長目的東非狒狒、人、獼猴和黑猩猩聚為1類；食肉目的雪貂和靈長目聚為1類，之后又與食肉目家犬聚為1類；偶蹄目的綿羊、山羊、家牛聚為1類；奇蹄目的家馬和驢聚為1類，再與偶蹄目、食肉目及靈長目相聚類。在Neto2基因遺傳進(jìn)化上，家兔與嚙齒目親緣關(guān)系最近，與偶蹄目、奇蹄目、食肉目及靈長目親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與鳥綱、兩棲綱、魚綱之間親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

3 討論

KARs是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸鹽離子通道蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。KARs由5種亞基(GluK1-5)[9]組成，在突觸傳遞、神經(jīng)元興奮、樹突生長、神經(jīng)發(fā)育等生命活動中發(fā)揮重要作用[10-12]。Neto2蛋白質(zhì)是新發(fā)現(xiàn)的KARs輔助亞基，通過調(diào)節(jié)KARs的通道特性來影響其功能。Neto2與KARs的GluK2亞型結(jié)合，可增加GluK2受體開放概率和脈沖時間，加速脫敏恢復(fù)，從而提高KARs穩(wěn)態(tài)電流[13]。Sheng等發(fā)現(xiàn)，Neto2通過與GluK1氨基末端區(qū)(ATDs)結(jié)合協(xié)助GluK1進(jìn)行突觸轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。Tang等研究發(fā)現(xiàn)，Neto2的C-末端盤狀同源區(qū)域(PDZ)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與谷氨酸受體相互作用蛋白(glutamate receptor-interacting protein，簡稱GRIP)相互作用，同時GRIP可以與GluK2的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，過表達(dá)Neto2可增強(qiáng)GRIP與GluK2的結(jié)合，從而增加KARs在突觸后膜的穩(wěn)定性[15]。Vernon等研究發(fā)現(xiàn)，Neto2蛋白質(zhì)高表達(dá)于新生背根神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)損傷或者敲除基因Neto2后，活化的絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MEK/ERK)上調(diào)Neto2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)軸突的再生及KARs在感覺神經(jīng)元中的作用[16]?，F(xiàn)有研究表明，Neto2蛋白質(zhì)對KARs的調(diào)節(jié)具有多樣性，深入研究Neto2調(diào)控KARs的機(jī)制，將有可能為進(jìn)一步研究癲癇、阿爾茲海默癥、疼痛及中風(fēng)等疾病的治療方法提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

本研究通過對家兔Neto2蛋白質(zhì)的分子特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，家兔Neto2蛋白質(zhì)由518個氨基酸殘基組成，其中大部分氨基酸具有較強(qiáng)的親水性，說明該蛋白質(zhì)易溶于水。家兔Neto2蛋白質(zhì)含有信號肽，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器內(nèi)。信號肽不僅決定蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白質(zhì)，也和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)[17]。說明該蛋白質(zhì)為分泌蛋白質(zhì)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，能通過囊泡運(yùn)輸至相應(yīng)細(xì)胞區(qū)域，具有運(yùn)輸和結(jié)合作用。

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能最基本、最普遍、最重要的機(jī)制，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用。糖基化可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)眾多生物學(xué)功能[18]。分析結(jié)果表明，家兔Neto2蛋白質(zhì)中存在62個磷酸化位點(diǎn)，3個糖基化位點(diǎn)，且推測家兔Neto2蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。因此，磷酸化和糖基化可使家兔Neto2變得穩(wěn)定，在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞間信號傳遞和神經(jīng)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等活動中受蛋白質(zhì)激酶的調(diào)節(jié)。據(jù)此，筆者推測蛋白質(zhì)的磷酸化、糖基化修飾對家兔Neto2蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

分子進(jìn)化即微觀進(jìn)化，依賴于核酸和蛋白質(zhì)的序列信息，是闡明物種間相互關(guān)系的分子基礎(chǔ)[19-20]。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，家兔Neto2蛋白質(zhì)與小家鼠、褐家鼠、黃金鼠之間的關(guān)系最近，表明Neto2蛋白質(zhì)在家兔和小家鼠、褐家鼠、黃金鼠中相對保守。家兔Neto2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲、α-螺旋含量較高，三級結(jié)構(gòu)中長鏈卷曲分布較多。家兔Neto2蛋白質(zhì)可以和Necab1、Necab2、NCK1、SHCBP1、Grik5等蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，說明家兔Neto2蛋白質(zhì)具有磷酸化活性，在生長發(fā)育、跨膜運(yùn)輸、突觸傳遞、KARs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及β-淀粉樣蛋白質(zhì)生成等過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究對家兔Neto2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步研究家兔Neto2蛋白質(zhì)的表達(dá)和生物活性奠定了工作基礎(chǔ)。