楚敏，林青，張志東，高雁，史應(yīng)武，楊紅梅，霍向東， 顧美英，曾軍，李玉國，歐提庫爾，張濤

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆石油天然氣資源蘊藏豐富，有各類沉積盆地49個，主要分布在準噶爾盆地、塔里木盆地、吐魯番—哈密盆地。中石油就在新疆礦權(quán)區(qū)內(nèi)擁有潛在石油資源量156×108t、天然氣資源量7.6×105m3，占中石油國內(nèi)能源量的1/4，但截至目前已探明的油氣儲量不足其1/5。[1,2]因此，加大相關(guān)區(qū)域的油氣資源勘探，對增大我國能源自給,保障我國能源安全具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】油氣微生物勘探法最早是Mogilewskii[3]在1937 年提出的，其主要原理是利用油氣藏中的輕烴氣體在壓力驅(qū)動下，以微泡上浮或連續(xù)氣相流形式垂直地向上運移，進入表層沉積物過程, 一部分成為土壤中專性烴氧化菌的食物而使烴氧化菌異常發(fā)育，預(yù)測地層是否存在油氣藏。1986～2000 年，Phillips[4]公司在我國南海北部和渤海4個合作區(qū)塊的勘探中, 先后采用了美國微生物石油調(diào)查勘探技術(shù)。2007年，微生物石油勘探技術(shù)第一次進入我國陸上油氣勘探領(lǐng)域[5,6]。土壤微生物群落多樣性反映了群落整體的動態(tài)變化，通過土壤微生物對不同碳源的利用程度分析，可以進一步了解微生物群落的結(jié)構(gòu)組成[10]?！颈狙芯壳腥朦c】焉耆盆地位于新疆巴州境內(nèi), 橫跨庫魯克山，區(qū)域油氣蘊藏豐富，類型豐富。目前已在焉耆盆地發(fā)現(xiàn)寶浪油田和本布圖油田, 在南部凹陷博南地區(qū)發(fā)現(xiàn)低產(chǎn)巖性油氣藏，寶中深層八道灣組發(fā)育低產(chǎn)的斷鼻油藏[7]。研究土壤微生物群落代謝活性及多樣性對地下油氣儲藏情況的響應(yīng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Biolog-ECO板分析法，對焉耆地區(qū)不同含油氣的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和碳源代謝特征進行分析，研究其微生物對地下油氣的響應(yīng)，為建立和驗證微生物油氣勘探技術(shù)，加快新疆油氣資源的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣品采集于新疆巴音郭楞蒙古自治州(以下簡稱巴州)焉耆縣境內(nèi)油氣田(86°31′～86°35E，41°06′～42°01′N)，海拔高度在1 042～1 045 m。降水稀少，蒸發(fā)量大，日照時間長，熱量較為豐富。年平均降水量為64.7 mm，蒸發(fā)量大于降水量，年平均蒸發(fā)量為年平均降水量的18.5倍，無霜期175 d[ 7,8]。

對照樣品采集于巴州和碩縣境內(nèi)農(nóng)田(86°57′～86°58E，42°16′～42°17′N)，海拔高度在1 100～1 160 m。屬暖溫帶大陸性干旱氣候，空氣干燥，風沙較多，日照充足。圖1

圖1 采樣區(qū)域與焉耆地區(qū)地下藏油氣Fig.1 The circumstances of sampling area and the oil and gas in the underground reservoir in Yanqi area

樣品于2014年4月采集，采集地位于巴州焉耆縣內(nèi)，油氣分布[1,8,9]，分別對無地下藏油氣、較有利于藏油氣和利于藏油氣三個區(qū)域進行采樣。采樣以設(shè)定區(qū)域中心按環(huán)形曲線采樣，每個區(qū)域設(shè)8個采樣點，每個采樣點采用五點梅花采集樣本。樣品采集取各采樣點80～100 cm 土層，并分別用無菌袋密封，放置于車載冰箱4℃保存，并盡快帶回實驗室進行Biolog試驗測定[10]。表1

1.2 方 法

1.2.1 土壤樣品理化參數(shù)測定

采集土壤樣品48 h內(nèi)(送至新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所)進行土壤樣品測定，包括pH、總鹽、有機質(zhì)、有機碳、全氮等理化參數(shù)。樣品的pH 值測定采用電位法，總鹽測定采用質(zhì)量法，有機質(zhì)測定采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法，全氮測定采用半微量凱氏定氮法。

1.2.2 土壤微生物群落代謝活性

按文獻[10]。稱取10 g 土壤于90 mL 無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的250 mL 三角瓶中，30℃ 下充分振蕩1 h，靜置3 min 。將上清液倒入水槽然后靜置10 min。按 150 μL/孔加到Biolog-ECO板，置于30℃ 培養(yǎng)10 d，每隔24 h 測定590 nm 處的OD值。

表1 土壤樣品采集地理信息

Table 1 Geographic information of the soil sample collection

序號Order number經(jīng)度Longitude緯度Dimension海拔(m)Altitude無地下藏油氣區(qū)域(CK)No oil and gas CK1E86.57.413N42.16.9971 108CK2E86.58.412N42.16.8981 115CK3E86.58.544N42.16.8861 112CK5E86.58.544N42.16.8861 112CK6E86.58.011N42.16.9581 116CK7E86.58.755N42.17.0381 116CK9E86.58.894N42.16.9801 116CK11E86.58.803N42.16.9341 114利于藏油氣區(qū)域(T1)For oil and gas5E86.32.428N42.01.5231 0676E86.32.028N42.01.6351 0578E86.32.010N42.01.9131 06211E86.32.671N42.01.8051 05713E86.32.693N42.01.6991 05716E86.33.225N42.01.2351 05417E86.33.446N42.01.2541 05919E86.33.786N42.01.3931 065不利于或難評價藏油氣區(qū)域(T2)Or difficult to evaluate the oil and gas23E86.34.360N41.58.7461 05124E86.34.396N41.58.6561 05925E86.34.420N41.58.5431 06127E86.34.695N41.58.4571 05533E86.34.819N41.58.0401 05736E86.35.015N41.57.7701 05038E86.35.397N41.57.0501 05540E86.35.650N41.58.0171 050

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

按Biolog-ECO 板31種碳源的分子結(jié)構(gòu)式分為六大類，即單糖糖苷聚合糖類(7種)、氨基酸類(6種)、脂類(4種)、醇類(3種)、胺類(3種)、酸類(8種)，分析土壤微生物對不同類型碳源的利用情況。

哦，那可能是我這兩年不再練武，肌肉力量不行了，所以才得了這腰椎管狹窄癥吧。我這樣想著。這時候，旁邊的小孫兒說話了：“蘇大夫，怎么能預(yù)防腰椎管狹窄癥的發(fā)生啊，我有好多同事也都有這樣的癥狀了?！?/p>

分別計算OD590與OD750的差，其中數(shù)值小于0的修正為0，數(shù)值的大小代表土壤微生物代表不同碳源的活性[11]。Biolog-Eco 每孔顏色平均變化率(AWCD)是表征樣品中微生物群落對底物碳源利用強度的指標，反映樣品中微生物活性、微生物群落生理功能多樣性的一個重要指標。微生物代謝總強度采用微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率(Average Well Color Development, AWCD) 來描述，AWCD 值越大，表明土壤微生物代謝功能越強。計算公式如下:

式中，Ci為各反應(yīng)孔OD590與OD750的差值；R為ECO 板對照孔A1的OD590與OD750的差值。i-R小于零的孔，計算時記為零，即：Ci-R≥0[12]。

微生物群落多樣性指數(shù)采用Simpson、Shannon-Wiener 和McIntosh 等指數(shù)來表征土壤微生物群落功能多樣性。

群落Shannon 豐富度指數(shù)(H')[13]：

H'=ΣPilnPi.

式中，Pi為第i孔相對吸光值與整板平均相對吸光值總和的比，即：Pi=(Ci-R)/Σ(Ci-R)。

群落Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)(D)：

式中，ni為第i孔相對吸光值(Ci-R)，N為相對吸光值的總和，Simpson 指數(shù)通常用1/D值表示。

式中，ni為第i孔相對吸光值(Ci-R)[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

平均吸光值(AWCD)、多樣性指數(shù)、主成分分析(PCA) 和相關(guān)的方差分析等數(shù)據(jù)處理均采用DPS 9.50進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試土壤樣品理化性質(zhì)

各樣品為堿性土壤，有機營養(yǎng)比較匱乏，樣品間差異不明顯。由表可以看出所采集的樣品土壤pH在8.08～8.21，呈現(xiàn)弱堿性；總鹽在0.35%～0.40%，有機質(zhì)在0.41%左右，全氮含量在0.33%左右，總體呈現(xiàn)有機營養(yǎng)匱乏，樣品間差異不明顯。表2

表2 不同區(qū)域樣品土壤基本理化性質(zhì)

Table 2 The basic information and physico-chemical of the soil samples

樣品SamplepH總鹽Total salt(%)有機質(zhì)OM(%)全氮Total N(g/kg)CK8.08±0.020.35±0.210.45±0.040.31±0.00T18.21±0.110.37±0.030.40±0.010.33±0.03T28.09±0.010.40±0.010.41±0.070.33±0.01

2.2 不同土樣的微生物群落AWCD

研究表明，來源于不同油氣類型土壤樣品AWCD值均隨培養(yǎng)時間增加而提高，總體上AWCD 值均呈“S”型曲線變化，培養(yǎng)144 h后各樣品AWCD基本達到最大值，增長趨于穩(wěn)定。具體觀察，在整個培養(yǎng)期間三類樣品的微生物活性存在著明顯的差異，總體呈顯著T1>T2>T3的規(guī)律，即利于藏油氣區(qū)域微生物活性>不利于或難于評價藏油氣區(qū)域>無藏油氣區(qū)域，但T2與T1間差異明顯小于與CK的差異。圖2

圖2 不同類型樣品土壤微生物AWCD值

Fig.2 AWCD values of soil microbes in different types of samples

2.3 不同土樣微生物群落多樣性指數(shù)

研究表明，在利于藏油氣(T1)和不利于或難評價藏油氣(T2)區(qū)域樣品中的微生物SIMPSON優(yōu)勢度指數(shù)、McIntosh均勻度均低于對照區(qū)域，且均呈現(xiàn)T1T3>CK的趨勢。表3

表3 藏油氣樣品土壤微生物群落多樣性指數(shù)

Table 3 The index of soil microbial community in oil and gas samples

序號OrderSIMPSON(D)SHANNON(H)BRILLOUINMcIntosh(Dmc)CK1.021 4233.188 913.078 2871.057 126T10.995 4533.253 4743.536 1220.981 485T21.008 453.251 7543.325 6431.023 951

2.4 不同土樣微生物群落對六大碳源利用

根據(jù)各樣品AWCD變化情況，選取光密度趨于穩(wěn)定，且不同樣品間有較好分形的96 h的AWCD值，進行土壤微生物群落不同類型碳源利用的差異分析。研究表明，各樣品土壤微生物對6類碳源代謝和利用存在明顯的差別。通過分析樣品中土壤微生物利用各類碳源情況，來源于利于藏油氣和不利于或難評價藏油氣區(qū)域的土壤微生物利用6類碳源的活性均高于對照區(qū)域，其中，在羧酸類、酚酸類、多聚類、胺類等4類化合物的微生物利用活性中，均呈現(xiàn)T1>T2>T3的規(guī)律，與總體AWCD情況一致；而在碳水化合物、氨基酸等2類化合物的微生物利用活性中，均呈現(xiàn)T2>T3> T1的規(guī)律。圖3，表4

研究表明，三類樣品中利用碳水化合物、氨基酸、酚酸的微生物均占主導(dǎo)，總計占70%以上，其次為多聚物占10%以上，而羧酸和胺類所占比例最少，均低于10%。分析不同碳源對各樣中總體AWCD的貢獻情況可以看出，在利于藏油氣和不利于或難評價藏油氣區(qū)域，即T1和T2樣品中，氨基酸和多聚物利用微生物在AWCD的貢獻上均高于對照區(qū)域，而羧酸、胺類均低于于對照區(qū)域。表4

圖3 不同類型樣品土壤中各碳源AWCD值

Fig.3 AWCD values of carbon sources in different types of soil samples

表4 不同類型樣品土壤中各類碳源利用微生物對AWCD貢獻

Table 4 Contribution of microbes to AWCD in different types of soil samples

碳水化合物Carbohydrate氨基酸Amino acid羧酸Carboxylic acid酚酸類Phenolic acids多聚物Polymer胺類AmineCK35.1620.477.0418.9111.277.13T133.6421.016.6120.2611.916.56T236.3221.266.3917.8312.785.40

2.5 微生物群落代謝活性主成分(PCA)

主成分分析( principal component analysis，PCA) 是采用降維的方法，使用少數(shù)的相互無關(guān)的綜合指標反映原統(tǒng)計數(shù)據(jù)中所包含的絕大多數(shù)信息。不同類型樣品PCA分析表明，前3個主成分可解釋樣品間70.9%的變異，其中主成分1(PCA 1)、主成分2(PCA 2)分別解釋了39.69%、16.63%。以PCA 1、PCA 2對各樣品作圖，三個不同藏油氣區(qū)域微生物群落特征，在PCA 1、PCA 2有著明顯分異。圖4

圖4 不同藏油氣區(qū)域土樣微生物群落主成分

Fig.4 Principal component analysis of microbial communities in soil samples from different reservoirs

PCA中的因子載荷可反映不同土壤碳源利用的差異，絕對值越大，表明該基質(zhì)的影響越大，在眾多碳源中起主要分異作用，PCA 1載荷在0.7以上的有15種基質(zhì)，其中因子載荷系數(shù)r>0.8的有10種基質(zhì)；PCA 2載荷在 0.6以上的2種基質(zhì)，其中r>0. 8的只有1種為D-木糖。 PCA 1、PCA 2中權(quán)重最大的基質(zhì)為D-甘露醇和D-木糖，分別為載荷值0.97和0.87。表5

表5 主成分因子載荷值

Table 5 Principal component factor load value

碳源carbon sourcePCA 1PCA 2碳源carbon sourcePCA 1PCA 2碳源carbon sourcePCA 1PCA 2?-甲基D-葡萄糖苷Methyl D- glucoside-0.130.21L-精氨酸L- arginine-0.020.37y-羥基丁酸y-hydroxybutyric acid0.55-0.16D-半乳糖內(nèi)酯D- galactone0.71*0.04L-天冬酰胺酸L- asparagine acid0.86**-0.28衣康酸Itaconic acid0.43-0.52D-纖維二糖cellobiose0.38-0.19L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine0.70*-0.55a-丁酮酸a-butanic acid0.80**0.43I-赤藻糖醇l-Trehalose0.270.39L-絲氨酸l-serine0.70*0.09D-蘋果酸D-Malic Acid0.72*0.33a-D-乳糖a--D- lactose0.31-0.59L-蘇氨酸L- threonine0.430.69*丙酮酸甲脂Pyruvate methyl ester0.580.31葡萄糖-1-磷酸鹽Glucose -1- phosphate0.70*0.54甘氨酰-L-谷氨酸Glycine-L-glutamate0.620.21苯乙基胺Benzethylamine-0.02-0.33D-木糖D- xylose0.250.87**2-羥苯甲酸2-hydroxybenzoic acid0.380.6腐胺Putrescine-0.160.21D-甘露醇D- mannitol0.97**-0.154-羥基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid0.96**-0.19D-葡萄胺酸D- glucosaminic acid0.87**-0.25N-乙?；?D-葡萄胺N-acetyl-D-glucamine0.560.51吐溫80Twain 800.80**-0.43肝糖Liver sugar0.79**0.4D,L-a-甘油D, L-a- glycerol0.230.56吐溫40Twain 400.88**-0.23D-半乳糖醛酸D- galactosidonic acid0.86**-0.27a-環(huán)式糊精a- cyclodextrin0.86**-0.32

注：*顯著，**極顯著

Note:*marked，**Extremely significant

3 討 論

我國先后在渤海灣盆地淺海海域、瓊東南盆地、松遼盆地，青海省的蘇干湖盆地、柴達木盆地等地區(qū)，開展了相關(guān)微生物油氣勘探[15-21]。丁力等[22]針對準噶爾盆地中拐凸起火山巖儲層巖性變化大、油水分布規(guī)律復(fù)雜、油氣勘探面臨較大困難等問題，運用微生物地球化學(xué)勘探技術(shù)通過檢測地表土壤中烴氧化菌的豐度差異，研究土壤吸附氣的組成特征，來圈定油氣分布范圍，判別油氣藏流體性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測結(jié)果與工區(qū)已知鉆井試油結(jié)果具有較高的吻合度，證實了微生物地球化學(xué)勘探技術(shù)在中拐凸起火山巖油氣藏勘探中的適用性。

Biolog微平板技術(shù)最初主要用于微生物菌種鑒定的一種技術(shù)，通過分析微生物利用單一碳源情況，進行數(shù)值分析。由于該技術(shù)操作簡單、快速、獲得數(shù)據(jù)量豐富，隨著近年來微生物生態(tài)學(xué)研究的深入，樣品間利用Biolog微平板碳源代謝差異，分析微生物群落代謝功能多樣性已成為一種重要的分析手段。研究前期，研究團隊利用Biolog革蘭氏陰性板進行了新疆瑪北油氣藏區(qū)微生物群落代謝活性[23]，采用判別分析模型判斷油氣藏區(qū)微生物異常，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油氣藏區(qū)判別正確率為97.8%，非油藏區(qū)判別正確率為100%，總判別正確率為98.6%，證明BIOLOG技術(shù)能高效準確的用于油氣藏初步勘測[15]。

研究分別從新疆焉耆無地下藏油氣、較有利于藏油氣和利于藏油氣三個區(qū)域進行采樣。將采取的52個土壤樣品進行土壤理化性質(zhì)分析和BIOLOG法對研究背景區(qū)域內(nèi)油氣藏區(qū)、非油氣藏區(qū)以及各樣點間的土壤微生物群落代謝功能差異進行研究。結(jié)果表明，在整個培養(yǎng)期間三類樣品的微生物活性存在著明顯的差異，總體呈顯著T1>T2>T3的規(guī)律，即利于藏油氣區(qū)域微生物活性>不利于或難于評價藏油氣區(qū)域>無藏油氣區(qū)域。多樣性指數(shù)分析表明，在利于藏油氣和不利于或難評價藏油氣區(qū)域樣品中的微生物SIMPSON優(yōu)勢度指數(shù)、McIntosh均勻度均低于對照區(qū)域，而 SHANNON(H)豐富度指數(shù)、BRILLOUIN指數(shù)結(jié)果相反，表明地下油氣對該區(qū)域的樣品微生物組成和分布有影響。土壤微生物利用各類碳源情況分析表明，來源于利于藏油氣和不利于或難評價藏油氣區(qū)域的土壤微生物利用6類碳源的活性均高于對照區(qū)域，在羧酸類、酚酸類、多聚類、胺類等4類化合物的微生物利用活性中，均呈現(xiàn)T1>T2>T3的規(guī)律；各樣品中不同碳源代謝微生物對AWCD的貢獻情況表明，利于藏油氣和不利于或難評價藏油氣區(qū)域樣品中，氨基酸和多聚物利用微生物在AWCD的貢獻上均高于對照區(qū)域，而羧酸、胺類均低于對照區(qū)域。主成分分析表明，三個不同藏油氣區(qū)域微生物群落特征，在PCA 1、PCA 2有著明顯差異，PCA 1、PCA 2中權(quán)重最大的基質(zhì)為D-甘露醇和D-木糖，分別為載荷值0.97和0.87，進一步驗證BIOLOG技術(shù)能用于油氣藏初步勘測。

4 結(jié) 論

新疆焉耆三個區(qū)域地下土壤微生物群落明顯受油氣分布影響。微生物代謝活性總體呈現(xiàn)利于藏油氣區(qū)域微生物活性>不利于或難于評價藏油氣區(qū)域>無藏油氣區(qū)域的規(guī)律；在利于藏油氣和不利于或難評價藏油氣區(qū)域樣品中，氨基酸和多聚物利用微生物在AWCD的貢獻上均高于對照區(qū)域，而羧酸、胺類均低于對照區(qū)域。主成分分析表明，三個不同藏油氣區(qū)域微生物群落分布特征有著明顯差異，PCA 1、PCA 2中權(quán)重最大的基質(zhì)為D-甘露醇和D-木糖，分別為載荷值0.97和0.87。