石繼祥，商培洋，周 旭，周 強(qiáng)，章篩林，龐金輝，周軍杰，虞陸超， 衛(wèi)彥強(qiáng)，郝勝坤，王文燕，莊偉康，朱鵬飛

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院， 上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院骨科,上海 200062)

淋巴系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)重要組成部分，其主要功能是將組織液轉(zhuǎn)輸?shù)窖芏厝胙h(huán)，這對人體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1]。淋巴回流功能一旦發(fā)生障礙，其結(jié)果必然是組織液過剩而出現(xiàn)機(jī)體水腫，隨之而來的是代謝產(chǎn)物、炎性因子等局部蓄積，從而導(dǎo)致包括膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[2]。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，KOA多有關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，且病程中伴隨著明顯的淋巴管結(jié)構(gòu)及功能變化，表明淋巴管功能障礙可能是KOA的重要機(jī)制之一[3]。KOA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”“骨痹”等范疇，其病機(jī)為肝腎虧虛，外邪乘虛襲于經(jīng)絡(luò)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，臨床治療常以補(bǔ)腎活血為主。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，同時結(jié)合我院傷科經(jīng)驗(yàn)，自擬補(bǔ)腎活血方隨證加減，可有效緩解KOA關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等癥狀，促進(jìn)膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)且療效確切[4-5]。本研究擬觀察補(bǔ)腎活血方對KOA小鼠淋巴管功能的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎活血方組成：懷牛膝12 g，骨碎補(bǔ)12 g，補(bǔ)骨脂10 g，水蛭5 g，雞血藤30 g，黃芪24 g，川芎12 g，當(dāng)歸24 g，熟地黃24 g，甘草9 g等，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院/普陀區(qū)中心醫(yī)院藥劑科提供。將小鼠(20 g)與人(60 kg)的常規(guī)中藥用量按《實(shí)驗(yàn)動物藥理學(xué)》進(jìn)行換算(換算系數(shù)9.01)，則小鼠所服補(bǔ)腎活血方(166 g)煎劑濃度為1.75 g/ml；取上述中藥5劑加5倍水(4150 ml)浸泡30 min，煮沸后繼續(xù)煎煮30 min，以消毒紗布過濾得首煎液；所余藥渣再加5倍水(4150 ml)，重復(fù)以上步驟得次煎液；將2次煎液混合后加熱濃縮至477 ml，得補(bǔ)腎活血方濃縮煎劑，-80℃冰箱保存以備用。

1.2 主要試劑與儀器

高精確電子天平(Biotech德國)；TP1020型組織脫水機(jī)、RM2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1220型烘片機(jī)、OLYMPUS BX50熒光顯微鏡、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡(LEICA德國)；BX-50型生物倒置顯微鏡(Olympus日本)；JEM-1200EX 透射電鏡圖像數(shù)字分析儀(Bio-Rad美國)；小動物麻醉機(jī)(Matrx VMR 美國)；近紅外成像系統(tǒng)(Fluoptics-Hubtech21 Inc.美國)；吲哚菁綠(ICG，Acorn美國)；異氟烷(深圳沃瑞德科技有限公司NO.217140901)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級10周齡雄性C57BL/6 小鼠30只，體質(zhì)量(23 ±2)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供(動物許可證號SCXK(滬)2017-0005)。SPF級動物房中飼養(yǎng)，室溫15～25℃，濕度 45%～60%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，常規(guī)飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)腎活血方組3組各10只。所有實(shí)驗(yàn)獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

模型組(meniscal-ligamentous injury induced osteoarthritis，MLI-OA，半月板副韌帶損傷OA模型)及補(bǔ)腎活血方組小鼠均采用右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚切口，以膝關(guān)節(jié)為中心，長約5 mm，暴露并切斷內(nèi)側(cè)副韌帶后打開膝關(guān)節(jié)，找到內(nèi)側(cè)半月板前部并分離其與脛骨的附著點(diǎn)，然后切除內(nèi)側(cè)半月板前部，縫合皮膚關(guān)閉切口；假手術(shù)組小鼠皮膚切口相同，但只切開關(guān)節(jié)囊而不切斷其他結(jié)構(gòu)[3,6]。

2.2 藥物干預(yù)

造模結(jié)束后，術(shù)后第2天補(bǔ)腎活血方組小鼠即開始灌胃給藥，每次灌胃量為0.2 ml/只；假手術(shù)組和模型組小鼠則給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次，4周為1個療程，持續(xù)12周。

2.3 膝關(guān)節(jié)腫脹度測量

在造模當(dāng)天及術(shù)后4、8、12周分別測量小鼠腫脹程度。用游標(biāo)卡尺測量每組小鼠右膝關(guān)節(jié)橫向直徑(mm)，計(jì)算膝關(guān)節(jié)腫脹度(%)[7]，公式為：膝關(guān)節(jié)腫脹度(%)=(右膝關(guān)節(jié)直徑-左膝關(guān)節(jié)直徑)/左膝關(guān)節(jié)直徑×100。

2.4 淋巴管回流功能檢測

每4周使用近紅外線-吲哚菁綠成像系統(tǒng)(indocyanine green-near infrared，NIR-ICG) 檢測淋巴管回流變化情況，將小鼠使用異氟烷麻醉后雙下肢脫毛，以30號針頭注射10 μL的ICG(濃度為0.1μg/ml，蒸餾水溶解，避光保存)染料于小鼠髕韌帶中間注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，在NIR照射下觀察熒光信號，淋巴管的信號強(qiáng)度趨于穩(wěn)定后觀測24 h (期間每隔1 s拍照1次，圖片保存以備分析)，記錄信號漸由膝關(guān)節(jié)經(jīng)集合淋巴管進(jìn)入腹股溝淋巴結(jié)過程。使用Image J軟件可計(jì)算膝關(guān)節(jié)ICG的信號強(qiáng)度(signal，S)及達(dá)峰時間(Tmax)變化情況；并計(jì)算膝關(guān)節(jié)周圍淋巴管的ICG清除率[3,8-9]，如ICG注射后6 h的清除率(Clearance)=(S6h-S1h)/ S1h×100%。

2.5 組織病理學(xué)檢測及評分

于術(shù)后4、12周處死小鼠，每組5只，剔除周圍皮膚及肌肉，完整膝關(guān)節(jié)進(jìn)行10%福爾馬林固定后，用10% EDTA脫鈣，每日更換新鮮液，直至組織軟化為止約3～4周。脫鈣后流水沖洗24 h除酸，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、切片。層厚4 μm，進(jìn)行Safranin-O染色。顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的染色情況和結(jié)構(gòu)的完整性，以及軟骨縱裂或侵蝕的深度，并依據(jù)Safranin-O染色進(jìn)行OARSI評分(見附表1)[10]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎活血方對小鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

表1顯示，測量小鼠右膝關(guān)節(jié)橫徑以分析其腫脹度變化，結(jié)果模型組小鼠右膝關(guān)節(jié)腫脹度于術(shù)后4、8、12周呈現(xiàn)顯著上升(與假手術(shù)組比較，P<0.01)，表明模型組小鼠患側(cè)膝關(guān)節(jié)存在持續(xù)的炎癥反應(yīng)；補(bǔ)腎活血方小鼠術(shù)后仍有關(guān)節(jié)腫脹，但已明顯緩解(與模型組比較，術(shù)后8周，P<0.05；術(shù)后12周，P<0.01)。

表1 小鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度變化比較

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；##P<0.01

3.2 補(bǔ)腎活血方對小鼠淋巴管回流功能影響

圖1表2顯示，ICG微注射入膝關(guān)節(jié)腔后使用NIR-ICG系統(tǒng)行淋巴管功能檢測，記錄其ROI(region of interest，箭頭所示)區(qū)域ICG信號強(qiáng)度并使用Image J行定量分析；同時記錄分析ICG 清除率(ICG clearance)及達(dá)峰時間(Tmax)。術(shù)后12周，模型組小鼠淋巴管回流功能明顯減弱，表現(xiàn)為ICG清除率顯著下降(6 h、12 h及24 h，與假手術(shù)組比較，P<0.05或P<0.01)，ICG達(dá)峰時間Tmax延長(與假手術(shù)組比較:P<0.01)；補(bǔ)腎活血方可改善小鼠ICG清除率(與模型組比較，6 h為P<0.05，12 h及24 h為P<0.01)，同時可縮短ICG達(dá)峰時間Tmax(與模型組比較:P<0.01)，表明其小鼠淋巴管回流功能得到改善。

3.3 補(bǔ)腎活血方對小鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響

圖2表3顯示，石蠟切片、 Safranin-O染色后鏡下觀察， 假手術(shù)組小鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、完整，軟骨層無裂縫、侵蝕；軟骨細(xì)胞規(guī)則排列于軟骨陷窩內(nèi)呈柱狀排列，軟骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)無異常；模型組小鼠術(shù)后12周呈現(xiàn)OA典型表現(xiàn)，包括軟骨裂隙(紅箭頭)、關(guān)節(jié)游離體(綠箭頭)及關(guān)節(jié)軟骨丟失(黑箭頭)，補(bǔ)腎活血方組小鼠術(shù)后12周軟骨丟失明顯改善；其OARSI評分亦顯著下降(與模型組比較，術(shù)后12周，P<0.05)、關(guān)節(jié)軟骨丟失面積亦有所減少(與模型組比較，術(shù)后12周，P<0.01)，提示補(bǔ)腎活血中藥可有效延緩關(guān)節(jié)退變。

注：ICG微注射后使用NIR-ICG系統(tǒng)顯影成像，記錄其ROI(region of interest，箭頭所示)區(qū)域ICG光信號強(qiáng)度并使用Image J行定量分析。圖中顯示注射后1、6、12及24 h后ICG強(qiáng)度在各組變化情況圖1 小鼠膝關(guān)節(jié)淋巴回流功能檢測

4 討論

眾所周知，關(guān)節(jié)周圍物質(zhì)和能量代謝“動態(tài)平衡”是保證關(guān)節(jié)正常功能的關(guān)鍵。維持這種“動態(tài)平衡”主要依賴于淋巴管。淋巴管包括毛細(xì)淋巴管及成熟淋巴管2種，它們在形態(tài)、細(xì)胞組成及功能上均存在差異。毛細(xì)淋巴管主要由排列疏松的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞組成，而成熟的淋巴管除有緊密吻合的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞外，外層還覆蓋可特異性表達(dá)a平滑肌蛋白，并具有收縮功能的淋巴管平滑肌細(xì)胞，而管腔內(nèi)還有防止淋巴倒流的瓣膜，淋巴管平滑肌細(xì)胞收縮和瓣膜共同構(gòu)成“淋巴泵”，促進(jìn)淋巴回流以協(xié)助單向收集淋巴液[11-12]，最后流入靜脈，是組織液流入血液的媒介，被稱為“第二循環(huán)系統(tǒng)”。淋巴系統(tǒng)的回流功能正常與否取決于其結(jié)構(gòu)是否完整，尤其是成熟淋巴管的數(shù)量分布。

表2 各組小鼠淋巴管回流功能比較

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

表3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

注：石蠟切片， Safranin-O染色后鏡下觀察。模型組術(shù)后12周呈現(xiàn)OA典型表現(xiàn)，包括軟骨裂隙(紅箭頭)、關(guān)節(jié)游離體(綠箭頭)及關(guān)節(jié)軟骨丟失(黑箭頭)，補(bǔ)腎活血方組術(shù)后12周軟骨丟失明顯改善圖2 小鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測

一直以來(1990年前)，OA被認(rèn)為是“磨損”(wear and tear)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞形成的骨關(guān)節(jié)病。隨著研究的逐漸深入，目前已公認(rèn)OA是一種炎癥性疾病而非單純的骨關(guān)節(jié)病[13]。早在2010年，Zhou等[14]利用吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)近 紅 外(near Infrared，NIR)淋巴成像技術(shù)，檢測急慢性炎性關(guān)節(jié)炎(包括OA及RA等)的淋巴管回流功能，提示在炎性關(guān)節(jié)炎過程中淋巴管功能發(fā)生改變。Xu H等[15]、Walsh DA等[16]及Shi[3]等的研究中，在OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中伴隨淋巴管數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能改變；而在OA小鼠關(guān)節(jié)周圍毛細(xì)淋巴管增加，但成熟淋巴管形成減少、淋巴回流下降，同時伴隨軟骨下骨髓水腫；由此可見，淋巴增生可能是OA重要的病理機(jī)制之一，而促進(jìn)增生的毛細(xì)淋巴管成熟，增強(qiáng)其淋巴回流功能，將炎癥介質(zhì)及時清除將是OA治療的新方向。已有研究結(jié)果表明，改善淋巴回流功能有利于TKA(終末期OA)術(shù)后患者的恢復(fù)[2]；Zhou等[17]采用重組過表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-c，VEGF-C)腺病毒，注射到同為炎性關(guān)節(jié)炎的RA小鼠踝關(guān)節(jié)內(nèi)，3個月后其淋巴回流功能增強(qiáng)，淋巴管生成增加，同時踝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜炎癥減輕。Zgraggen 等[18]的研究同樣證實(shí)，淋巴管的生成參與慢性炎癥、過敏性疾病等過程。2015年Liang等[19]的研究表明，阻斷淋巴管生成及淋巴回流功能，無論是小鼠RA還是OA，其病情均明顯加快加重，與中醫(yī)“痹癥”的發(fā)病類似。

中醫(yī)對于“痹病”(OA)病因病機(jī)的闡述最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！端貑枴け哉摗分赋觯骸帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也?！闭J(rèn)為該病的主要病因是正氣不足、風(fēng)寒濕邪侵襲所致。以內(nèi)因肝腎氣血虧虛、風(fēng)寒濕邪外襲、痰濕互結(jié)、痹阻經(jīng)絡(luò)為主要病因病機(jī)，因此扶正祛邪、補(bǔ)腎活血通絡(luò)為其重要的治療法則。補(bǔ)腎活血方是依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論結(jié)合上海許氏傷科經(jīng)驗(yàn)擬定而成，已應(yīng)用臨床多年且療效確切[4-5]。方中骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、熟地黃、懷牛膝補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨；黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)益氣血；雞血藤、水蛭活血破瘀；甘草調(diào)和諸藥，諸藥合用共奏補(bǔ)益肝腎、活血逐瘀之功?，F(xiàn)代研究亦發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血通絡(luò)類中藥可有效抑制炎性因子，如白細(xì)胞介素-1、6，腫瘤壞死因子-α等分泌，阻斷骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[20]，降低關(guān)節(jié)一氧化氮水平，延緩關(guān)節(jié)退變[21-22]，其具體靶點(diǎn)尚無定論。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方可有效改善OA模型組小鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度，降低其OARSI評分，延緩關(guān)節(jié)退變，同時促進(jìn)淋巴管回流功能，在ICG達(dá)峰時間縮短的同時，淋巴管清除率上升，證實(shí)補(bǔ)腎活血方治療組淋巴管功能有所改善，清除能力得到提高。這些初步研究提示，淋巴管有可能是該方消腫及延緩關(guān)節(jié)炎癥及軟骨退變的可能機(jī)制，即促進(jìn)淋巴回流而改善膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境代謝障礙(炎癥介質(zhì)蓄積)，促進(jìn)局部微循環(huán)，加速炎癥介質(zhì)及分解酶類，如基質(zhì)金屬蛋白酶及整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶等有害物質(zhì)的代謝，從而達(dá)到消除關(guān)節(jié)腫脹、延緩關(guān)節(jié)退變的作用。無須諱言，淋巴功能和OA相關(guān)性的研究目前仍屬于相對較新的領(lǐng)域，其中還有很多問題尚未厘清。如OA炎癥與淋巴管增生和功能究竟存在何種因果關(guān)系？補(bǔ)腎活血中藥如何影響淋巴管生成和淋巴回流功能，其中的分子機(jī)制是什么，又是通過哪些信號通路實(shí)現(xiàn)的，這些問題急需進(jìn)一步解決。之后本課題組將對補(bǔ)腎活血方中中藥各主要有效成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，利用基因芯片等技術(shù)對其靶基因、信號通路分子進(jìn)行篩選驗(yàn)證，深入探討其對淋巴管增生、成熟及回流功能的作用效應(yīng)、靶點(diǎn)及其相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)，以便探索其延緩OA的淋巴機(jī)制，解密其“除痹”密碼。