公緒合 綜述 李虹偉 審校

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心臟中心代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

心血管疾病在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、死亡率高，隨著經(jīng)皮冠脈介入術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的發(fā)展，心肌梗死患者的生存有了大幅度改善。然而，這些幸存者中大部分由于心肌細(xì)胞凋亡和心肌重構(gòu)最終死于心力衰竭。心肌組織難以增殖和分化，目前心臟移植是終末期心力衰竭的最終治療選擇，但移植供體來源、倫理學(xué)限制等，使得心臟移植數(shù)目有限。因此，需要研究用于心肌梗死和心力衰竭新的治療方法，以改善這些患者的預(yù)后。

目前，許多學(xué)者研究了干細(xì)胞治療心肌梗死和缺血性心力衰竭的療效，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在臨床研究中顯示了良好的安全性和有效性。最早的基礎(chǔ)研究表明，MSCs有分化為多種類型細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的潛力。然而，隨后的研究并沒有證實(shí)MSCs顯著的分化能力，大多數(shù)靜脈注射的干細(xì)胞在肺內(nèi)潴留，而不是心臟；而且即使通過冠狀動(dòng)脈移植干細(xì)胞，移植14 d后僅僅有6%的細(xì)胞潴留在梗死區(qū)域。進(jìn)一步研究顯示MSCs培養(yǎng)液上清能夠改善心臟功能，這說明干細(xì)胞移植改善心臟功能，不是通過心肌細(xì)胞分化，而是旁分泌作用。許多干細(xì)胞旁分泌因子直接修復(fù)再生心肌組織，為未來無細(xì)胞治療提供了一種選擇，外泌體(exosome)作為干細(xì)胞旁分泌的集合體，在旁分泌治療心血管疾病中被廣泛研究?，F(xiàn)綜述外泌體在心血管疾病治療中的作用和研究進(jìn)展。

1 外泌體概述

外泌體是從細(xì)胞中釋放的直徑30～100 nm的小囊泡，是個(gè)復(fù)雜的集合體，包括多種細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、miRNAs和核糖體RNAs等[1]。最早由Johnstone等研究者在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)現(xiàn)，后來研究發(fā)現(xiàn)各種細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體。比如從慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分泌的miR-126可以進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞黏附和遷移。

外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間的中樞介質(zhì)，將蛋白質(zhì)、mRNAs和miRNAs等轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞，從而在生物體中發(fā)揮調(diào)控作用。同樣，MSCs可以合成和分泌富含高磷脂的功能性外泌體，比如脂肪MSCs分泌的外泌體可以調(diào)節(jié)MSCs的血管生成潛能[2]。此外，注射骨髓MSCs外泌體至腦梗死大鼠能夠促進(jìn)梗死病灶區(qū)血管和神經(jīng)生長。在心血管研究領(lǐng)域，干細(xì)胞外泌體的治療作用更是得到了高度認(rèn)可，下面將從不同的角度闡述干細(xì)胞外泌體與心血管疾病研究。

2 外泌體對(duì)心血管系統(tǒng)作用

2.1 抗凋亡作用

心肌梗死由于冠狀動(dòng)脈血管狹窄、堵塞，心肌供血不足，發(fā)生進(jìn)行性心肌細(xì)胞凋亡和丟失，最終引起心力衰竭，由于心肌細(xì)胞難以再生，使得修復(fù)梗死心肌成為治療難點(diǎn)。MSCs的出現(xiàn)為修復(fù)心肌細(xì)胞提供了治療方法，其作用不是直接分化為心肌細(xì)胞，而是旁分泌作用能夠抗心肌細(xì)胞凋亡[3-4]。

最近的研究報(bào)道，骨髓MSCs延緩缺血性心肌細(xì)胞損傷，外泌體靶向轉(zhuǎn)移miR-22結(jié)合甲基CpG結(jié)合蛋白2以抑制心肌細(xì)胞凋亡。外泌體miR-221通過抑制p53表達(dá)，上調(diào)凋亡蛋白Bcl-2，介導(dǎo)骨髓MSCs的抗凋亡作用。p53介導(dǎo)凋亡與Bcl-xL和p53相互作用，激活促凋亡蛋白而抑制抗凋亡蛋白，而MSCs外泌體通過miR-221抑制p53介導(dǎo)的凋亡，能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞生存[5]。既往細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用MSCs條件培養(yǎng)基處理缺氧無血清的h9c2心肌細(xì)胞，結(jié)果同樣顯示MSCs條件培養(yǎng)基能夠抗缺氧誘導(dǎo)h9c2心肌細(xì)胞凋亡，而外泌體就存在于條件培養(yǎng)基中。綜上研究表明，外泌體參與了抗心肌細(xì)胞凋亡的過程。

2.2 抗炎癥作用

眾所周知，樹突狀細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的外泌體均參與抑制炎癥反應(yīng)的過程，被認(rèn)為是治療某些疾病的新方法[6]。同樣，一些研究也證明來源于骨髓的MSCs外泌體在心血管疾病治療中有類似作用，比如MSCs外泌體抑制炎癥來減輕肺動(dòng)脈高壓[7]。同樣，在缺血再灌注心肌損傷研究中，MSCs外泌體也可以減少梗死面積，改善心臟功能[8]。在心力衰竭研究中，白介素-1β在誘發(fā)心力衰竭發(fā)病中起重要作用，而MSCs能夠分泌高水平的白介素-1受體拮抗劑，從而調(diào)控心力衰竭的發(fā)生[9]。這些研究揭示了在心血管疾病中，MSCs外泌體通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

2.3 抗心肌重構(gòu)

心肌重構(gòu)是各種心血管疾病的代償方式，比如最常見的心力衰竭后心臟擴(kuò)大和心肌纖維化，往往缺乏有效的治療方法[10]。自體MSCs移植能夠減少心肌梗死面積、改善心肌重構(gòu)[11]，從而進(jìn)一步提高心臟功能。

心肌重構(gòu)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中往往采用左心室大小、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs外泌體通過激活促存活信號(hào)，減少氧化應(yīng)激來增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，防止心肌缺血再灌注損傷后的不利重構(gòu)。在MSCs治療心力衰竭的臨床研究中，干細(xì)胞主要通過旁分泌作用促進(jìn)內(nèi)源性心臟修復(fù)，改善心肌重構(gòu)[12]。前期對(duì)轉(zhuǎn)基因擴(kuò)張型心肌病心力衰竭小鼠進(jìn)行MSCs治療，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植組小鼠高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子-1，這也證實(shí)了旁分泌作用在改善心肌重構(gòu)中的關(guān)鍵作用[13]。雖然MSCs外泌體抗心肌重構(gòu)的作用是明確的，但是其具體機(jī)制仍然不清楚，需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究證實(shí)。

2.4 促進(jìn)血管新生

心力衰竭時(shí)，各種病理微環(huán)境下誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死和凋亡，相應(yīng)的藥物治療、手術(shù)治療、介入治療方法有限。MSCs和心臟干細(xì)胞分化促進(jìn)血管新生成為新的治療方法，心臟前體細(xì)胞釋放外泌體能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞再生和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)血管新生[14]。其中MSCs和心臟干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用比單一MSCs更加能夠減少心肌梗死面積，改善心功能[15]。血管新生成為干細(xì)胞外泌體治療心血管疾病的研究靶點(diǎn)。然而對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞新生在傳導(dǎo)系統(tǒng)、心房肌、心室肌之間的變化差別無相關(guān)的研究，這將是一個(gè)新的研究方向。

3 外泌體與心血管疾病

3.1 心肌梗死

心肌梗死是心臟冠狀動(dòng)脈血管的急性或慢性堵塞，引起心肌細(xì)胞凋亡、壞死。干細(xì)胞治療心肌梗死研究最多、最充分，MSCs移植到梗死心肌能夠改善心功能，這與MSCs修飾上調(diào)miR-1、促進(jìn)MSCs生存和分化為心肌細(xì)胞有關(guān)。在心肌缺血微環(huán)境下，有趣的是MSCs外泌體包括上調(diào)的miR-22，可靶向結(jié)合甲基CpG結(jié)合蛋白2以抗心肌細(xì)胞凋亡。再者，外泌體同樣可以抗心肌纖維化，這些意味著心肌梗死時(shí)干細(xì)胞外泌體發(fā)揮了心臟保護(hù)作用[4]。同時(shí)認(rèn)為存在一個(gè)外泌體調(diào)節(jié)系統(tǒng)，能夠促進(jìn)保護(hù)因子、蛋白向梗死組織遷移，發(fā)揮保護(hù)作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞及血管新生修復(fù)[16]。

目前，干細(xì)胞外泌體治療心肌梗死的研究往往在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，心肌梗死后外泌體治療時(shí)間從心肌梗死后即刻至1周內(nèi)均有相關(guān)的研究，最終改善心臟功能的機(jī)制與旁分泌作用相關(guān)，主要是外泌體改善了心肌梗死微環(huán)境，通過促血管新生、抗凋亡等機(jī)制改善心肌重構(gòu)，提高心臟功能。

3.2 缺血再灌注損傷

大量研究證實(shí)缺血再灌注損傷時(shí)，由于過多自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致不可逆的結(jié)構(gòu)損傷和器官功能障礙[17]；盡管維生素E和類似物作為抗氧化劑，能夠抗缺血再灌注損傷，但其作用有限，很少在臨床應(yīng)用。MSCs能夠促進(jìn)血管新生，減少梗死面積，改善左心功能，作為治療缺血再灌注的新方法，在缺血再灌注之前5 min至再灌注后1周內(nèi)使用，結(jié)果顯示MSCs分泌外泌體能夠減少氧耗應(yīng)激，提高ATP、NADH，控制炎癥，激活PI3K/Akt通路[8]，從而保護(hù)心肌細(xì)胞生存，改善左心功能，這些均提示外泌體可作為缺血再灌注損傷的治療方法。

3.3 肺動(dòng)脈高壓

肺動(dòng)脈高壓是一種肺血管壓力增高的疾病，引起右心衰竭甚至死亡。缺氧引起的肺部炎癥和高氧所致肺發(fā)育不良可能是肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)MSCs比目前臨床應(yīng)用的藥物更加能夠改善肺動(dòng)脈高壓的預(yù)后，并且在肺動(dòng)脈高壓的大鼠實(shí)驗(yàn)中得到反復(fù)驗(yàn)證，揭示了其作用機(jī)制：減少肺血管重構(gòu)和炎癥，促進(jìn)血管生成，改善肺毛細(xì)血管的通透性[18]。

肺動(dòng)脈高壓后的肺血管重構(gòu)與缺氧誘發(fā)的肺部炎癥密切相關(guān)。MSCs外泌體能夠抑制缺氧信號(hào)通路的激活，平衡靶向Th1/Th2及下調(diào)增殖的miR-17(miR-17能夠升高右心室收縮壓，促進(jìn)右心室肥厚)，最終抑制肺動(dòng)脈高壓。另外，外泌體干擾信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)-miR204-STAT3反饋系統(tǒng)，改善血管重構(gòu)。上述研究結(jié)果證明干細(xì)胞外泌體通過抑制早期肺部炎癥反應(yīng)和改善血管重構(gòu)來抗肺動(dòng)脈高壓。

4 外泌體治療心血管疾病的未來和挑戰(zhàn)

自從發(fā)現(xiàn)外泌體后，外泌體治療心血管疾病引起了人們的廣泛關(guān)注，MSCs外泌體在治療心血管疾病包括心肌梗死、肺動(dòng)脈高壓、缺血再灌注損害中發(fā)揮重要作用，機(jī)制涉及到抗心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)再生修復(fù)等，其中深入的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

與傳統(tǒng)的干細(xì)胞移植比較，外泌體治療具有更小的創(chuàng)傷，減少了異常分化的可能性(比如干細(xì)胞分化為骨、脂肪，甚至腫瘤)。因此，體外純化的外泌體移植比單純干細(xì)胞移植更加具有吸引力，外泌體的作用更多歸功于miRNA、蛋白、功能性細(xì)胞因子。然而如何保證這些有益的細(xì)胞因子、蛋白、miRNA定向向損傷組織歸巢是目前的巨大挑戰(zhàn)，也是未來研究外泌體的關(guān)鍵。隨著MSCs外泌體的產(chǎn)生、機(jī)制及作用的研究，干細(xì)胞外泌體必將成為有前景的治療心血管疾病的策略。