鄧 敏，梁光華

（重慶市涪陵區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶涪陵408000）

0 引言

布魯氏菌病是布魯氏菌（Brucella）引起的人畜共患病。布魯氏菌是胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球狀桿菌或短桿菌，無芽孢，有莢膜，無鞭毛不能運動，是在嚴格厭氧條件下不生長的需氧菌。1985年WHO將布魯氏菌屬分為6個種19個生物型。近年隨著分子生物學技術的發(fā)展，尤其是PCR方法的廣泛應用，基因分型技術已開始進入實驗診斷和流行病學調(diào)查。目前，PCR方法對布魯氏菌的實驗鑒定以種鑒定為主，可以診斷布魯氏菌屬、種、型的范圍，方法準確、可靠。并在該領域得到了廣泛的應用，應用細菌學PCR方法對涪陵區(qū)的布魯氏菌種、型開展病原學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2014—2016年，從清溪鎮(zhèn)2個養(yǎng)羊場通過虎紅平板和試管凝集試驗檢測，確定為布病陽性羊場，從這2個場中采集的羊流產(chǎn)胎兒分別收集獲得6份、4份，共10份組織樣品，標記為試驗樣品菌株，標準菌株羊種3型陽性對照、陰性對照購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標準PCR Markers（DL2000）購自大連寶生物工程有限公司，組織基因DNA抽提試劑盒購買于Qiagene公司；PCR反應引物由上海生工生物工程有限公司合成提供。

1.3 方法

（1）常規(guī)布魯氏菌的鑒定。將10份樣品菌毒株和1份陽性對照羊3型標準菌株進行生化培養(yǎng)實驗。該實驗在無菌環(huán)境下操作，分別將這10份樣品加入布魯氏菌肉湯0.5 mL中，使陽性對照凍干物溶解。取0.1 mL溶解物均勻涂布于布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基上，同時接種于布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)48～96 h。根據(jù)菌落生長時間和形態(tài)、菌體染色等實驗，并參照各菌生長特性判定其生物種、型。該實驗在某三級生物安全實驗室操作。

（2）PCR病原學檢測。根據(jù)說明書操作，判定標準，在陰陽性對照成立的條件，根據(jù)DNA擴增帶進行判定。該實驗在某三級生物安全實驗室操作。

2 結果

2.1 布魯氏菌常規(guī)生化檢測

樣品進行布魯氏菌常規(guī)檢驗，11個樣品野菌株和標準菌株樣品中，其中8份樣品和羊3型菌株分離到無色、半透明，圓形、表面光華、邊緣整齊、中央稍凸起，直徑有2～3 mm菌落，有2份樣品無細菌生長。用革蘭氏染色，鏡檢，布氏桿菌染成紅色。該菌對光、熱、常用化學消毒劑等均很敏感；根據(jù)菌落生長時間和形態(tài)、菌體染色、血清學診斷等實驗，并參照各菌生長特性判定其種型，結果8個樣品與標準菌株的培養(yǎng)形態(tài)、染色一致。

2.2 病原學檢測

將布魯氏菌的羊3型標準株和8份陽性樣品菌株共9株毒株的培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增實驗，經(jīng)過1.5%的瓊脂糖電泳凝膠，擴增出731bp大小的目的片段，陰性對照無目的擴增片段。8份樣品株與標準菌株片段一致，可以得出結論，涪陵區(qū)山羊布病病原為羊種3型。

3 討論與分析

近年來，我國流行的布氏菌主要是牛種菌和羊種，患布魯氏菌病羊是我國人間布病最主要的傳染源，近年致病菌主要是羊種3型布魯氏菌。一般羊種3型對人、畜均有較強的毒力和侵襲力，且致病力也較強，易引起布病的暴發(fā)和流行，且疫情重。涪陵區(qū)為黑山羊養(yǎng)羊特色區(qū)域，因此在未免疫的情況下，尤其需要需要對羊布魯氏菌病采取有效可行的控制措施，嚴格按照法律法規(guī)來防止布魯氏菌病的發(fā)生。

目前，涪陵區(qū)畜牧獸醫(yī)局動物疫病預防控制中心與涪陵區(qū)衛(wèi)生部門疾控中心已經(jīng)開展溝通與合作，創(chuàng)建聯(lián)防聯(lián)控、群防群控的局面，實施長期監(jiān)測、以及同步信息，建立布魯氏菌病聯(lián)合防控機制，各司其職，密切協(xié)助，互通疫情信息，共同做好涪陵區(qū)人畜共患病的防控工作、保障人民的身體健康、以及養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展。

本實驗通過對布魯氏菌病PCR方法和細菌學常規(guī)檢測方法的使用，結果證明樣品PCR試驗的檢測和常規(guī)實驗檢測結果一致，而且使用PCR檢測方法縮短了檢測時間，同時該方法的首次使用，為涪陵區(qū)動物疫病預防控制中心獸醫(yī)實驗室能快速有效的診斷布魯氏菌病奠定了基礎。