尹富禹，盧欣，吳曉鵬

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦俏覈侨蚍秶媾R的最重要的公共衛(wèi)生問題之一。目前，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）是臨床最重要的血運(yùn)重建一線治療方案，大大降低了患者死亡率，但PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄仍是影響長期預(yù)后的頑疾[1]。術(shù)后輔以阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板藥物對(duì)于預(yù)防PCI圍手術(shù)期不良心血管事件的發(fā)生尤為重要[2]。氯吡格雷是血小板表面二磷酸腺苷（ADP）受體拮抗劑，具有不可逆抑制血小板聚集作用[3]。P-選擇素是一種表達(dá)在活化的血小板表面的、富含半胱氨酸高度糖化的I型跨膜蛋白，與血小板的粘附和聚集密切相關(guān)[4]。研究顯示，P-選擇素基因含有多個(gè)脆性位點(diǎn)[5]，但這些位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與氯吡格雷反應(yīng)性的關(guān)系尚無定論，尤其是西部人群中P-選擇素基因多態(tài)性的研究十分鮮見。在西安地區(qū)漢族人群中進(jìn)行了P-選擇素基因多態(tài)性初步研究，分析PCI術(shù)后患者服用氯吡格雷后血小板抑制率、ADP誘導(dǎo)的最大凝塊強(qiáng)度（MAADP）及反映血小板活性指標(biāo)，如血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（VASP）、可溶性CD40（sCD40）、P-選擇素水平的變化與P-選擇素基因多態(tài)性關(guān)系，為臨床用藥提供新思路，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料隨機(jī)選取2015年3月～2016年12月于西電集團(tuán)醫(yī)院順利完成PCI術(shù)的冠心病患者374例，其中男性209例，女性165例，年齡43～81（63.85±9.42）歲，記錄受試者的一般臨床資料。本研究已獲西電集團(tuán)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。1.2 患者入選和排除標(biāo)準(zhǔn)入選標(biāo)準(zhǔn)：①在本地居住20年以上的漢族患者；②由2位介入專家進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心病并具有行PCI術(shù)的指征（血管狹窄≥75%）；③既往未接受過PCI術(shù)治療；④所有患者均完成P-選擇素基因測序；⑤獲得患者及家屬對(duì)本項(xiàng)研究的知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；②患者在治療前出現(xiàn)嚴(yán)重的意識(shí)障礙、心力衰竭、伴有嚴(yán)重的肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染或伴有嚴(yán)重出血傾向者；③預(yù)計(jì)生存時(shí)間≤1年者；④相互間有血緣關(guān)系者；⑤阿司匹林和氯吡格雷禁忌癥者。

1.3 研究方法

1.3.1 患者一般資料包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、糖尿病史、血脂異常史、高血壓史、吸煙史等。

1.3.2 治療方法術(shù)前口服負(fù)荷劑量硫酸氫氯吡格雷片（商品名：波立維?，生產(chǎn)廠家：杭州賽諾菲制藥有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20130083）300 mg+阿司匹林腸溶片（商品名：拜阿司匹林?，生產(chǎn)廠家：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20130078）300 mg。

1.3.3 血液樣本采集采集所有患者PCI術(shù)后3 d服藥2 h后的外周靜脈血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二鈉（EDTA-Na）抗凝劑的采血管中，用于檢測生化指標(biāo)；其余血液樣本于-70℃低溫保存，用于進(jìn)行DNA提取。

1.3.4 血液常規(guī)檢查采用SYSMEX XS-800i全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（日本希森美康公司）進(jìn)行血液常規(guī)檢測。嚴(yán)格按照儀器操作手冊(cè)進(jìn)行操作，所有檢測在2 h內(nèi)完成。包括糖化血紅蛋白（HbAlc）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等生化指標(biāo)。

1.3.5 血小板抑制率和MA-ADP采用5000型血栓彈力圖（TEG）凝血分析儀（美國Haemoscope公司）檢測血小板抑制率，血小板抑制率=[（MAADP-MAfibrin）/（MAthrombin-MAfibrin）]×100%。MA-ADP表示ADP誘導(dǎo)的血凝塊強(qiáng)度；MAfibrin表示纖維蛋白的凝塊強(qiáng)度；MAthrombin表示凝血酶誘導(dǎo)的凝塊強(qiáng)度。TEG軟件根據(jù)檢測結(jié)果自動(dòng)計(jì)算經(jīng)ADP 途徑誘導(dǎo)的血小板抑制率及MA-ADP。將ADP受體抑制率＜20%定義為氯吡格雷抵抗。

1.3.6 血液生化指標(biāo)采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測VASP、sCD40及P-選擇素（CD62p）的水平。試劑盒購自上海百奧生物科技有限公司；單克隆抗體由美國Abcam公司提供。分別計(jì)數(shù)104 血小板中與熒光抗體VASP、sCD40和CD62p結(jié)合的血小板數(shù)（陽性血小板），其中陽性血小板百分率用于表示ASP、sCD40和CD62p的表達(dá)水平。

1.3.7 基因多態(tài)性檢測方法①采用Primer Express軟件（美國Applied Biosystems公司）設(shè)計(jì)引物和探針，由上海生工生物工程有限公司合成并提供。②外周血白細(xì)胞DNA提?。翰捎没蚪MDNA小量抽提試劑盒（由北京天根生物技術(shù)有限公司提供）。具體提取方法參照說明書進(jìn)行。采用紫外分光光度法測定DNA質(zhì)量和濃度。③進(jìn)行PCR-RELP：取8 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特異性限制性內(nèi)切酶（購自大連寶生生物工程有限公司），然后加入9 μl去離子水，于37℃反應(yīng)12～14 h。④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。⑤基因測序：將50 μl測序樣品送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化測序。根據(jù)Hapmap公共數(shù)據(jù)庫選擇P-選擇素基因的脆性位點(diǎn)，即-2123G/C、-1969G/A、-1817T/C位點(diǎn)。進(jìn)行大批量擴(kuò)增，電泳，酶切，確定基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)計(jì)算對(duì)照組的基因型分布是否符合 Hardy-Weinberg 平衡。符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表

2 結(jié)果

2.1 基因型分析本研究中，374例冠心病患者P-選擇素基因型檢出率為100%。-2123G/C位點(diǎn)基因型有3種，CC基因型（152 bp和95 bp，2條帶），GC基因型（247 bp、152 bp、95 bp，3條帶），GG基因型（247 bp，1條帶）；-1969G/A位點(diǎn)基因型有3種，AA基因型（101 bp和69 bp，2條帶），GA基因型（170 bp、101 bp、69 bp，3條帶），GG基因型（170 bp，1條帶）；-1817T/C位點(diǎn)基因型有3種，TT基因型（141 bp和74 bp，2條帶），TC基因型（215 bp、141 bp、74 bp，3條帶），CC基因型（215 bp，1條帶）（圖1）。

2.2 所有受試對(duì)象基因型分布P-選擇素基因-2123G/C、-1969G/A、-1817T/C位點(diǎn)在受試人群中的基因分型符合Hardy-weinberg平衡規(guī)律，其中-2123G/C位點(diǎn)（χ2=0.929，P＞0.05），-1969G/A位點(diǎn)（χ2=2.371，P＞0.05），-1817T/C位點(diǎn)（χ2=1.174，P＞0.05），表明受試對(duì)象的基因型分布可反映整體人群基因的分布情況（表1）。

表1 研究人群的基因型分布

圖1 P-選擇素基因位點(diǎn)電泳結(jié)果

2.3 P-選擇素基因多態(tài)性對(duì)血小板抑制率、MA-ADP以及血小板活化指標(biāo)的影響本項(xiàng)研究中，-2123G/C位點(diǎn)CC型基因攜帶者其血小板抑制率和VASP水平均較GG型、GG型基因攜帶者低，而MA-ADP、sCD40、CD62p水平則相對(duì)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是-1969G/A位點(diǎn)和-1817T/C位點(diǎn)不同基因型攜帶者血小板抑制率、VASP、MA-ADP、sCD40和CD62p水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

表2 受試對(duì)象的基因型分布

2.4 受試對(duì)象臨床基線資料比較在本項(xiàng)研究中，75例（20.05%）患者發(fā)生氯吡格雷抵抗，其余299例（79.95%）患者反應(yīng)正常。比較兩組患者的基線臨床資料，兩組患者年齡、性別組成、BMI、血壓、HbAlc、血脂水平、高血壓病史、血脂代謝異常史、吸煙史無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。此外，氯吡格雷抵抗組有糖尿病史的患者比例明顯高于氯吡格雷反應(yīng)正常者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

2.5 氯吡格雷抵抗組和非抵抗組患者P-選擇素基因型分布結(jié)合DNA測序技術(shù)確定了374例患者P-選擇素基因-2123G/C、-1969G/A、-1817T/C位點(diǎn)SNPs。其基因型分布如下，-2123G/C位點(diǎn)：54例氯吡格雷抵抗患者為GG野生型+GC雜合型，21例為CC突變型；-1969G/A位點(diǎn)：69例氯吡格雷抵抗患者為GG野生型+GA雜合型，6例為AA突變型；-1817T/C位點(diǎn)：49例氯吡格雷抵抗患者為TT野生型+TC雜合型，26例為CC突變型。經(jīng)多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析，P-選擇素基因的-2123G/C位點(diǎn)與氯吡格雷抵抗的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)（P＜0.05）。校正年齡、血脂指標(biāo)、糖尿病史后，-2123G/C位點(diǎn)仍然是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。未見P-選擇素基因-1969G/A位點(diǎn)和-1817T/C位點(diǎn)SNPs與氯吡格雷抵抗的關(guān)系（P＞0.05）（表4）。

3 討論

冠心病作為一種嚴(yán)重危害人類健康的心腦血管疾病之一，死亡率和致殘率較高，病因復(fù)雜，給患者家庭增加了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著我國冠心病人數(shù)的增加以及PCI術(shù)的推廣，服用氯吡格雷的患者數(shù)量也逐年增加，氯吡格雷反應(yīng)變異性已經(jīng)成為心血管領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在漢族人群中氯吡格雷抵抗的發(fā)生率約為4%～31%[6]，本研究中納入的374例患者中，75例（20.05%）患者發(fā)生氯吡格雷抵抗。氯吡格雷屬于新型抑制血小板聚集的噻吩砒啶類衍生物，主要通過不可逆地阻斷二磷酸腺苷受體，抑制纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集[7]。理論上，氯吡格雷具有很強(qiáng)的抗血小板活性作用，在實(shí)際應(yīng)用中，部分患者服用氯吡格雷血小板后無反應(yīng)或低反應(yīng)[8]。目前關(guān)于氯吡格雷抵抗的發(fā)生機(jī)制不明，普遍認(rèn)為血小板活化因子在氯吡格雷抵抗發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。

表3 氯吡格雷抵抗組和非抵抗組患者的基線資料比較

P-選擇素是一種高表達(dá)于活化血小板表面的、富含半胱氨酸高度糖化的整合I型跨膜蛋白，參與細(xì)胞間的選擇性識(shí)別與粘附，介導(dǎo)血小板活化、相互之間粘附聚集等過程，是目前發(fā)現(xiàn)的最具有特異性的血小板活化標(biāo)志分子[9]。氯吡格雷抵抗與多種因素密切相關(guān)，包括年齡、肥胖、吸煙、疾病史、遺傳因素等[10]，很多文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)功能蛋白基因的多態(tài)性是影響氯吡格雷反應(yīng)變異性一個(gè)重要因素[11]，研究較多的是CYP2C19基因[12]，但鮮少見到探討P-選擇素基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的關(guān)系。P-選擇素基因同樣也存在多個(gè)脆性位點(diǎn)，本研究著重分析亞洲人群最易發(fā)生突變的P-選擇素基因-2123 G/C、-1969 G/A和-1817 T/C位點(diǎn)的多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的關(guān)系。國內(nèi)曾進(jìn)行一項(xiàng)大樣本調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)漢族人群與泰國人群P-選擇素基因啟動(dòng)子區(qū)-2123C/ G、-1969G/A、-1817T/C 位點(diǎn)基因多態(tài)性不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[13]，但與白種人群，如英國、美國等比較，這三個(gè)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[14]。本研究納入的受試對(duì)象P-選擇素基因型分布符合Hardy-weinberg平衡規(guī)律。-2123G/C位點(diǎn)：54例氯吡格雷抵抗患者為GG野生型+GC雜合型，21例為CC突變型；-1969G/A位點(diǎn)：69例氯吡格雷抵抗患者為GG野生型+GA雜合型，6例為AA突變型；-1817T/C位點(diǎn)：49例氯吡格雷抵抗患者為TT野生型+TC雜合型，26例為CC突變型。經(jīng)多因素 COX 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析，P-選擇素基因的-2123G/C位點(diǎn)CC突變型可能是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。除外還發(fā)現(xiàn)-2123G/C位點(diǎn)CC型基因攜帶者其血小板抑制率和VASP水平均較GG型、GG型基因攜帶者低，而MA-ADP、sCD40、CD62p水平則相對(duì)較高。但-1969G/A位點(diǎn)和-1817T/C位點(diǎn)不同基因型攜帶者血小板抑制率、VASP、MA-ADP、sCD40和CD62p水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P-選擇素基因-2123G/C位點(diǎn)多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

表4 P-選擇素基因型與氯吡格雷抵抗的關(guān)系分析

綜上所述， P-選擇素基因-2123G/C位點(diǎn)多態(tài)性是導(dǎo)致氯吡格雷抵抗的一個(gè)重要原因。P-選擇素基因與血小板活化和聚集密切相關(guān)，P-選擇素基因的多態(tài)性研究處于起步階段，大量信息和脆性位點(diǎn)有待于深入研究，但本研究結(jié)果仍為解釋氯吡格雷抵抗的發(fā)生機(jī)制及冠心病PCI術(shù)后抗血小板治療提供了一定指導(dǎo)價(jià)值。需強(qiáng)調(diào)的是P-選擇素基因多態(tài)性只是氯吡格雷抵抗發(fā)生的重要因素之一[15]，尚需更多中心、大規(guī)模的研究來證實(shí)。