(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005)

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的樣品為某中型肉兔場(chǎng)的病兔與死兔的腸內(nèi)容物、糞便樣品以及兔舍附近的塵土樣品，一共采集135份實(shí)驗(yàn)樣品；實(shí)驗(yàn)采用的菌種為產(chǎn)氣夾桿菌A型以及腸致病性大腸桿菌；實(shí)驗(yàn)采用的試劑包括Taq DNA聚合酶、電泳級(jí)瓊脂糖以及無(wú)水乙醇等常規(guī)化學(xué)試劑；實(shí)驗(yàn)采用的菌培養(yǎng)基為麥康凱瓊脂培養(yǎng)基以及葡萄糖綿羊血瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌的分離培養(yǎng)

稱(chēng)取10 g樣品進(jìn)行預(yù)處理，并將其放置于90 mL 0.5%的緩沖蛋白胨水中，振蕩搖勻之后，將樣品液接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在37℃需氧以及42℃厭氧條件下過(guò)夜培養(yǎng)。在過(guò)夜培養(yǎng)之后，將37℃需氧培養(yǎng)獲得的樣品接種于麥康凱平板上，繼續(xù)放置于37℃需氧條件下，培養(yǎng)24 h之后，使用生理鹽水將平板上培養(yǎng)的菌落(粉紅色)洗脫收集；將42℃厭氧培養(yǎng)獲得的樣品接種于葡萄糖綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)放置于42℃厭氧條件下，培養(yǎng)時(shí)間控制在24～48 h，使用生理鹽水將培養(yǎng)基中的菌落(草綠色)洗脫收集。將獲得的兩種菌體進(jìn)行混合離心處理，并添加適量的雙蒸水備用[1]。

1.2.2 檢測(cè)樣品的制備

吸取1 mL的菌體混合物，在12 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 s，將上清液去除之后添加100 μL的滅菌去離子水或者PCR緩沖液，煮沸10 min后在12 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 s，選取上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR試驗(yàn)

(1)引物設(shè)計(jì)，通過(guò)DNAstar軟件進(jìn)行PCR試驗(yàn)引物的設(shè)計(jì)。其中，兔腸致病性大腸桿菌的引物位于eae A基因上，其擴(kuò)增片段為833bp；魏氏梭菌的引物在α毒素基因上，其擴(kuò)增片段為324bp。

(2)PCR反應(yīng)體系，在PCR試驗(yàn)過(guò)程中，總反應(yīng)體系為50 μL。包括10 μL的10×PCR buffer；5 μL的2.5mol/L dNTP；5 μL的模板；1.4 μL的23umol/L eae A引物；2.0 μL的αtoxin；0.3 μL的5 U/μL Taq酶。在添加上述反應(yīng)物之后，添加適量的三蒸水至50 μL。PCR試驗(yàn)的循環(huán)參數(shù)為：在94℃的條件下進(jìn)行5 min的預(yù)變性，并進(jìn)行30 s的變性；在56℃的條件下退火30 s；在72℃的條件下延伸1 min；在經(jīng)過(guò)30個(gè)上述循環(huán)之后，在72℃的條件下反應(yīng)10 min。

(3)產(chǎn)物分析，在PCR反應(yīng)完成之后，選擇10 μL的二重PCR產(chǎn)物，添加2 μL的加樣緩沖液，漿混合液放置于1.0%的瓊脂糖凝膠中，在90 V恒壓的條件下電泳，利用數(shù)字圖像分析儀進(jìn)行觀(guān)察與拍攝，并將DL2000DNA Marker作為分子量參照物，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病兔和死兔腸內(nèi)容物、糞便中含有大量的腸致病性大腸桿菌以及魏氏梭菌，兩者可以同時(shí)存在，也可以單獨(dú)存在；兔舍的飼料、飲水和生活污水中含有一定量的腸致病性大腸桿菌以及魏氏梭菌；在兔舍的塵土中，舍內(nèi)塵土中的腸致病性大腸桿菌的含量最高、舍外塵土及較遠(yuǎn)距離的塵土中腸致病性大腸桿菌的含量逐漸降低；兔舍塵土中的魏氏梭菌含量較少，而且不存在明顯變化。由此可以看出，在進(jìn)行肉兔養(yǎng)殖的過(guò)程中，不僅需要按照標(biāo)準(zhǔn)流程做好免疫工作，還需要保障兔舍的衛(wèi)生，避免兔舍外的污染物進(jìn)入到舍內(nèi)，防止肉兔出現(xiàn)腹瀉病。

3 結(jié)論

綜上所述，養(yǎng)殖人員需要提高對(duì)腸致病性大腸桿菌以及魏氏梭菌的重視，保障肉兔的健康生長(zhǎng)。通過(guò)試驗(yàn)可知，腸致病性大腸桿菌以及魏氏梭菌在飼料、兔舍塵土以及飲水中，養(yǎng)殖場(chǎng)的工作人員需要加強(qiáng)兔舍的衛(wèi)生管理，做好肉兔的疾病防疫工作，避免肉兔出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉病，保障養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益與養(yǎng)殖人員的身體健康。