徐 琳
(黑龍江省杜爾伯特蒙古族自治縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江 大慶 166200)
黃曲霉毒素M1(AFM1)是黃曲霉毒素B1(AFB1)的羥基化衍生物,二呋喃環(huán)的氧雜萘鄰酮作為其基本結(jié)構(gòu),分子式為C17H12O7,相對分子量為328Da,熔點可高達299℃。AFM1是一種無色的長方形片狀結(jié)晶,在365 nm紫外光照射下會呈現(xiàn)藍紫色熒光,其在極性有機溶劑中容易溶解,但在非極性溶劑(如乙醚、石油醚和正己烷等)中無法溶解。該毒素具有極強的耐熱性,只有在溫度達到299℃是才會被破壞,因此牛奶中所含的AFM1經(jīng)過常規(guī)烹調(diào)溫度、超高溫滅菌或者巴氏消毒后基本上不會被破壞。AFM1在部分化學試劑(如丙酮和次氯酸鈉)作用下可完全被分解,因此常用于對污染過AFM1的材料或者容器進行解毒。
免疫親和柱法。原理是對檢測樣品先進行離心、脫脂、過濾處理,接著使用免疫親和柱對濾液進行層析凈化,將所含雜質(zhì)除去后再來洗脫AFM1,之后通過熒光光度法對AFM1進行定量。樣品預處理,即取50 mL液體牛奶和牛乳制品放入離心管中,添加氯化鈉1 g,溶解后以4000 r/min的速度進行10 min離心,上層為脂肪層,移取下層液體,經(jīng)過玻璃纖維濾紙過濾后備用。柱凈化,即先連接玻璃注射器和免疫親和柱,準確吸取10 mL之前處理好的澄清濾液加入,接著連接空氣壓力泵,通過壓力調(diào)節(jié)控制溶液以3~6 mL/min的速度流過免疫親和柱,直到柱體有2~3 mL空氣通過,之后加入10 mL 10%甲醇溶液對柱子進行2次清洗,流出液體全部棄去,再準確加入1 mL 80%甲醇溶液將已經(jīng)免疫結(jié)合在柱上的AFM1洗脫,注意此時調(diào)整流速變?yōu)?~2 mL/min,將洗脫液收集在干凈的玻璃試管中待檢。熒光光度檢測,先分別在激發(fā)波長360 nm和發(fā)射波長450 nm下對熒光光度計進行校準,綠色標定管為0,紅色標定管為2.0,黃色標定管為1.0±0.2;接著在50 mLAFM1顯陰性的樣品中分別添加濃度為0、0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L的AFM1系列標準溶液,按照以上分析步驟進行分離純化,在濾過的洗脫液再分別添加1 mL 0.002%溴溶液和AFM1產(chǎn)生衍生物,放入熒光光度計中對熒光強度進行測定,由此繪制熒光強度和AFM1標準濃度的標準曲線;最后在待檢樣品洗脫液添加溴溶液衍生,對其熒光強度進行測定,根據(jù)標準曲線計算其中所含的AFM1。該檢測方法的優(yōu)點是凈化效果好、靈敏度高、特異性高等,同時樣品的前處理過程明顯簡化,不需要使用AFM1標準物質(zhì),使操作者在實驗過程中可能受到的潛在危害大幅度降低。但整個操作比較復雜、繁瑣,且容易出現(xiàn)浪費試劑和環(huán)境污染的情況,導致在一定程度上限制該方法的應用推廣。
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。原理是固定于酶標板上的抗原和待檢樣品中所含的AFM1會特異性競爭抗體,并在固相載體表面構(gòu)成抗原抗體復合物,將多余抗體成分洗去后添加酶標Ⅱ抗,與抗體反應,在酶的作用下促使顯色劑顯色,根據(jù)顯色深淺程度對樣品中所含的AFM1量進行判斷。樣品處理,即取50 mL待檢牛奶樣品,先進行降溫處理,直到溫度低于10℃,接著以3500 r/min的速度進行10 min離心,之后用吸管吸去上層脂肪層,取下層牛奶液進行檢測。檢測時,先將抗AFM1抗體包被于微孔板上,置于4℃條件下進行過夜處理,使其充分封閉;先在每孔中添加AFM1標準溶液或者樣品處理液,接著添加AFM1酶結(jié)合物,置于37℃下經(jīng)過30 min反應;洗板后在每孔中分別添加酶基質(zhì)和顯色劑,置于37℃下進行15 min顯色,通過目視法或者儀器法進行測定;根據(jù)結(jié)果繪制標準曲線,并據(jù)此計算樣品中所含的AFM1量。該檢測方法的優(yōu)點是特異性強、靈敏、快速、成本低等,儀器操作簡單,使工作人員的勞動量明顯減少,且待檢樣品無需經(jīng)過特殊處理,可直接進行測定,在有大批樣品進行檢測篩選使用,且在現(xiàn)場檢測時也可選用。
嚴格管理奶牛飼料。奶牛禁止飼喂發(fā)生霉變的飼料,因此在飼料生產(chǎn)、加工、運輸、保存過程中要加強管理,避免收獲飼料原料時經(jīng)受雨淋,且經(jīng)過適當曬干。合理控制青貯飼料質(zhì)量,防止腐敗,青貯飼料制作完成后要立即使用塑料薄膜覆蓋,盡可能使其密封。調(diào)控精飼料(如玉米、豆粕等)的含水量和溫度。確保飼料貯存條件良好,要求倉庫干燥、陰涼,且適當通風,還要注意飼料四周要留有適當?shù)膬Υ婵臻g。料倉要定期進行清潔,避免鼠咬和發(fā)生蟲害等,尤其是倉中全部腐敗變質(zhì)的飼料必須清理干凈。
加強檢驗檢測。要求乳制品生產(chǎn)企業(yè)采取質(zhì)量安全責任,并根據(jù)相關法律法規(guī)進行生鮮牛奶收購,且必須對其黃曲霉毒素M1等各項指標進行檢測。如果生鮮乳檢測不合格,要依法采取無害化處理。