馬穎穎

（大連工業(yè)大學(xué) 遼寧 大連 116600）

1 引言

在我國(guó)，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟化，以前轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物還停留在實(shí)驗(yàn)階段，目前開(kāi)始在具體的環(huán)境中得到利用。油菜籽、玉米、大豆以及棉花是百分之九十五的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物都集中于此。而且很多的農(nóng)作物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)上的商品化，其種植面積不斷擴(kuò)大化。作為糧油質(zhì)檢機(jī)構(gòu)，就要在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中遵循準(zhǔn)確、快速以及簡(jiǎn)便的原則進(jìn)行，在定量以及定性進(jìn)行進(jìn)口轉(zhuǎn)基因物的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行加強(qiáng)，就要確保監(jiān)督管理食品的安全性。

當(dāng)前對(duì)待轉(zhuǎn)基因的食品，人們?cè)絹?lái)越重視，而且更加重視其建立相關(guān)的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)簽制度，提高了更為嚴(yán)格的定量分析要求。在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的過(guò)程中采用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)進(jìn)行定性分析，因?yàn)榉磻?yīng)抑制、不適當(dāng)?shù)牟僮饕约案呙舾行圆顚?dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的方法已經(jīng)滿(mǎn)足不了現(xiàn)在的檢測(cè)要求。因?yàn)榭茖W(xué)技術(shù)的成熟化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的不斷創(chuàng)新，其操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、具有很高的靈敏度，可以定量地分析DNA模板，而且可以實(shí)時(shí)地檢測(cè)、沒(méi)有產(chǎn)生污染、結(jié)果準(zhǔn)確度高以及可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量

傳統(tǒng)PCR技術(shù)是可以定性進(jìn)行，隨著發(fā)展出現(xiàn)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技（(Realtime PCR），它可以實(shí)現(xiàn)定量核酸的技術(shù)。在美國(guó)AppliedBiosystems公司此技術(shù)就是由此開(kāi)始的，就是利用熒光基團(tuán)加入到PCR的反應(yīng)體系中，而且檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度以及DNA數(shù)量關(guān)系是線(xiàn)性相關(guān)。可以實(shí)時(shí)地對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程在熒光信號(hào)的積累下進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步DNA擴(kuò)增曲線(xiàn)就刻意得到，對(duì)于定量分析未知模板時(shí)其中之一的方式就是可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行。在PCR反應(yīng)中，DNA拷貝數(shù)就會(huì)產(chǎn)生，而且增大反應(yīng)循環(huán)數(shù)，DNA拷貝數(shù)增加是以指數(shù)的形式進(jìn)入到平臺(tái)期，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比較，由于傳統(tǒng)上定量分析PCR采用終點(diǎn)法存在缺陷，但實(shí)時(shí)技術(shù)可以彌補(bǔ)其缺陷，可以實(shí)時(shí)地在PCR反應(yīng)擴(kuò)增中進(jìn)行檢測(cè)，而且熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)連續(xù)的分析，就會(huì)擴(kuò)增，當(dāng)熒光信號(hào)被檢測(cè)出，就會(huì)得到曲線(xiàn)。

所以指數(shù)期間時(shí)PCR反應(yīng)可以進(jìn)行對(duì)PCR產(chǎn)物量的檢測(cè)，在某一個(gè)點(diǎn)進(jìn)行，進(jìn)一步對(duì)模板的起始含量進(jìn)行推斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)，處于指數(shù)期，為了更為對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，要進(jìn)行熒光信號(hào)閾值的設(shè)置，而且熒光的本底信號(hào)是基于PCR反應(yīng)之前的循環(huán)熒光信號(hào)進(jìn)行，數(shù)量確定15個(gè)。樣本的域值循環(huán)數(shù)Ct就可以用此進(jìn)行定義，其模板的Ct值和模板起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)是線(xiàn)性相關(guān)，Ct值隨著起始拷貝數(shù)的增加值越來(lái)越小。對(duì)于未知樣品Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)的曲線(xiàn)就可以對(duì)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

2.2 實(shí)時(shí)熒光

PCR類(lèi)型進(jìn)行實(shí)時(shí)地定量分析時(shí)有兩種方式：非探針類(lèi)(SYBR Green)以及探針類(lèi)，采用Tapman探針。前者擴(kuò)增產(chǎn)物的原理就是利用特殊的設(shè)計(jì)或者染料進(jìn)行，易操作，低成本，但是特異性低；后者對(duì)引物進(jìn)行指引的增加是用和靶序列特異進(jìn)行雜交的探針進(jìn)行，優(yōu)勢(shì)就是特異性較高。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)要求

2.3.1 實(shí)驗(yàn)室條件 根據(jù)《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求》(GB/T19495.2—2004)的相關(guān)要求設(shè)立PCR實(shí)驗(yàn)室，而且檢測(cè)質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)室的總體規(guī)定應(yīng)該遵循，糧食機(jī)構(gòu)就是定量定性地檢測(cè)對(duì)植物的樣本的轉(zhuǎn)基因。在對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的各區(qū)域避免不相關(guān)的人員進(jìn)入。檢驗(yàn)核酸時(shí)，如果條件允許，當(dāng)區(qū)域進(jìn)行隔開(kāi)時(shí)，就要有緩沖間的設(shè)置，而且緩沖間相連的工作區(qū)域壓力規(guī)定為正值，緩沖間為負(fù)壓，為了以免因?yàn)榭諝獾牧鲃?dòng)，導(dǎo)致所處的環(huán)境遭到污染，就要有連鎖的裝置的安裝在緩沖間以及工作間之間。檢驗(yàn)不同種類(lèi)的核酸時(shí)，工作區(qū)域應(yīng)該相互獨(dú)立，之間不能對(duì)開(kāi)門(mén)，并用標(biāo)志進(jìn)行區(qū)分。若是區(qū)域之間是相連的，要將物品傳遞窗進(jìn)行安裝，對(duì)此工作區(qū)就有要求，要進(jìn)行254nm波長(zhǎng)的紫外燈的安裝，而且是40W的，每隔20m2區(qū)域進(jìn)行安裝，燈和地面距離誤差在2.0±0.1m范圍。

由于實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)域就是對(duì)試劑進(jìn)行制備的區(qū)域，主要進(jìn)行分裝試劑、制備貯存的試劑以及制備在主反應(yīng)的混合液，所以就要進(jìn)行設(shè)置。要注意的是，沒(méi)有對(duì)控制氣流壓力有嚴(yán)格的規(guī)定，但是壓力梯度，為了以相鄰間的氣溶膠流動(dòng)污染，就要規(guī)定為正值，和鄰近區(qū)相反，注意在本區(qū)域盡量避免走動(dòng)。在區(qū)域進(jìn)行試劑的原材料貯存，而且它的制備也要在區(qū)域進(jìn)行。處理樣品就要提取樣品的核酸，進(jìn)一步進(jìn)行貯存，混合液進(jìn)行擴(kuò)增。

3 結(jié)語(yǔ)

傳統(tǒng)的熒光定量采用的是終點(diǎn)檢測(cè)的方式，但是利用PCR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)沒(méi)有后處理的步驟，如不需要進(jìn)行電泳，而且打破傳統(tǒng)方式，分析利用的是閉管，當(dāng)檢測(cè)人員檢測(cè)時(shí)，其目的產(chǎn)物同位素具有放射性，但是可以避免，而且核酸擴(kuò)增物會(huì)產(chǎn)生交叉的污染，但是利用此技術(shù)可以降低。所以，此技術(shù)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)更為靈敏，檢測(cè)時(shí)間減少，由于傳統(tǒng)檢測(cè)速度慢、而且并不具有特異性，PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)其提高，不僅在檢測(cè)致病菌上得以使用。而且在定量定性檢測(cè)糧油轉(zhuǎn)基因成分時(shí)，廣泛利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，促進(jìn)了在以后致病菌以及糧油轉(zhuǎn)基因成分的發(fā)展中更具有潛力。

[1]許安君.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用[J].糧油食品科技，2013，21(02):68-70.

[2]吳永彬.食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)研究[D].南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

[3]曾瑩.轉(zhuǎn)基因大豆、玉米特異品系LAMP檢測(cè)方法的研究[D].福建農(nóng)林大學(xué)，2013.