◎ 許再元

（中國廣州分析測試中心，廣東 廣州 510070）

雙歧桿菌是一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌，由于其對人體有諸多好處，如預(yù)防腹瀉，減少便秘，抗過敏、抗腫瘤、調(diào)整腸道功能及改善營養(yǎng)等，常作為一類體外攝入的活性菌添加到許多不同的食品中。對于雙歧桿菌的分離與鑒定方面的研究也隨著其作用的不斷發(fā)現(xiàn)得到了應(yīng)有的重視和發(fā)展。從1899年法國學(xué)者Tissier從母乳營養(yǎng)兒的糞便中分離出雙歧桿菌開始，雙歧桿菌已發(fā)現(xiàn)有32個(gè)亞型[1]。其鑒定的手段也從簡單的形態(tài)學(xué)上的描述鑒定發(fā)展到構(gòu)建了現(xiàn)代科學(xué)的分子進(jìn)化樹[2]。本文嘗試通過簡單的商業(yè)化API試劑條對6種雙歧桿菌進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

①試驗(yàn)中用到的標(biāo)準(zhǔn)菌株：長雙歧桿菌（ATCC15707）、短雙歧桿菌（ATCC15700）、青春雙歧桿菌（ATCC15703）、嬰兒雙歧桿菌（ATCC15697）、動物雙歧桿菌（CICC6165）。②試驗(yàn)中菌株的復(fù)蘇培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為商業(yè)化的MRS培養(yǎng)基，主要成分及配制方法：蛋白棟10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂粉15.0 g。將上述成分加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，校正pH 6.2后分裝，121 ℃高壓滅菌15 min[4]。③生化鑒定使用商業(yè)化的API20A與API50CH試劑條。

2 試驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)過程與最終鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照GB 4789.34-2016。為了保證菌株的活性和穩(wěn)定性，先將菌株在MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)劃線分離復(fù)蘇培養(yǎng)一代，再分別按照說明書使用API20A與API50CH試劑條配備的培養(yǎng)基（API50CH使用的是API50CHL培養(yǎng)基）配制菌液進(jìn)行試劑條的加樣，并將添加好試劑的試劑條放于厭氧罐中，在36 ℃下培養(yǎng)。

3 試驗(yàn)結(jié)果觀察

實(shí)驗(yàn)條每24 h觀察一次并記下結(jié)果，直到生化反應(yīng)試劑條顏色不再改變，其結(jié)果如下。

3.1 API20A結(jié)果

反應(yīng)24 h后滴加BCP的結(jié)果基本不再改變。所有的菌株測試結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫中皆能鑒定出為雙歧桿菌屬。分別落在其數(shù)據(jù)庫分類的雙歧桿菌屬一類與雙歧桿菌屬二類中。根據(jù)數(shù)據(jù)庫反饋的結(jié)果并不能將菌株鑒定到種。雖然，數(shù)據(jù)庫分類結(jié)果提示試驗(yàn)還能通過附加試驗(yàn)——牛奶消解試驗(yàn)、淀粉分解試驗(yàn)、β-GP試驗(yàn)等，進(jìn)一步進(jìn)行種的分類，但最終只能鑒定出其中的3種雙歧桿菌種。

3.2 API50CH結(jié)果

反應(yīng)24 h后開始觀察并記錄結(jié)果，每24 h觀察記錄一次。由于API50CH試劑條設(shè)計(jì)為乳桿菌的鑒定，其數(shù)據(jù)庫中并不能將結(jié)果鑒定為雙歧桿菌。所以，本實(shí)驗(yàn)參考了國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.34-2016里雙歧桿菌鑒定的生化鑒定結(jié)果進(jìn)行人工鑒定對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，API50CH試驗(yàn)所得的結(jié)果并不能與國家標(biāo)準(zhǔn)鑒定結(jié)果對應(yīng)，盡管結(jié)果只代表90%的菌株情況，在后續(xù)沒有其他實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的支撐下，最終難以得到讓人信服的結(jié)果。而且，在試驗(yàn)觀察中，API50CH中的某些反應(yīng)緩慢陽性需要等待長達(dá)5 d才能趨于穩(wěn)定不再改變，無形中對試驗(yàn)的鑒定結(jié)果時(shí)效性產(chǎn)生了重要影響。

4 結(jié)果與討論

API鑒定系統(tǒng)對于這6株菌株在屬水平上的鑒定是可以肯定的，但在種上的鑒定仍未能完善和涉及，這與雙歧桿菌生化反應(yīng)的多變特殊性不無關(guān)系。其中，多種糖發(fā)酵生化反應(yīng)涉及緩慢發(fā)酵的情況，往往對結(jié)果的判斷影響較大。因此，不能簡單地以陽性陰性一刀切的方式進(jìn)行判斷，但是一旦將反應(yīng)時(shí)間延長，一些環(huán)境因素引起的不確定性又會降低判定的準(zhǔn)確性。現(xiàn)在國際上并沒有統(tǒng)一通行的雙歧桿菌鑒定方式，特別在生化反應(yīng)這一方面，雙歧桿菌在種與種之間也沒有特殊肯定的反應(yīng)鑒別特點(diǎn)，這無疑成為在只使用生化反應(yīng)對雙歧桿菌鑒定到種的情況難以得到滿意結(jié)果的原因[5-7]。

當(dāng)然，使用最有效的分子手段，對菌株的關(guān)鍵遺傳信息進(jìn)行測序，是現(xiàn)今細(xì)菌鑒定最為認(rèn)可、準(zhǔn)確和直接的手段[1]。但這又往往對實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)人員以及成本與檢測時(shí)間有特殊的要求，目前的條件難以普及和做到實(shí)效。

另外，筆者認(rèn)為，在日常的食品檢測中，對雙歧桿菌的鑒定要鑒定到種的要求是否有必要也值得深思。

[1]周芳燁，梁國光，劉吉成.雙歧桿菌種類鑒定的基因?qū)W方法[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（9）：1088-1089.

[2]劉 洋，張清平，段文鋒.雙歧桿菌分子分型鑒定研究進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè)，2014，42（5）：43-47.

[3]張 勤，羅 燕，楊爾哈，等.雙歧桿菌分離鑒定的方法及其應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（3）：10-13.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB4789.35-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)[S].北京：國家標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]Martinez R C R，Wachsman M，Torres N I，et al. Biochemical, antimicrobial and molecular characterization of a noncytotoxic bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum, ST71KS[J].Food Microbiology，2013，34（2）：376-381.

[6]Guo X F，Wei Y L，Wang Y，et al.Identification of Bifidobacterium longum from Centenarians’ faeces and manufacture of fermented carrot juice[J].Journal of Agricultural Science & Technology，2015（1）：23-29.

[7]Bune?ová V，Vlková E，Killer J，et al.Identification of Bifidobacterium strains from faeces of lambs[J].Small Ruminant Research，2012，105（1-3）：355-360.