趙光偉,涂少宇,汪 洋,賀 然,賴(lài)靖堯,譚陽(yáng)春,郭道兵,牛晨霞,楊曉偉

(西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,重慶 榮昌 402460)

豬傳染性胃腸炎(TGE)與豬流行性腹瀉(PED)都是一種由冠狀病毒引起的一種急性胃腸道傳染病,臨床上以突然發(fā)病、傳播迅速、嘔吐、水樣腹瀉、脫水和2周齡以?xún)?nèi)仔豬高病死率為特征[1]。本病可發(fā)生于各種年齡段的豬,但對(duì)仔豬的影響最為嚴(yán)重。10日齡以?xún)?nèi)的仔豬病死率高達(dá)100%,5周齡以上的豬感染后病死率較低,成年豬感染后幾乎沒(méi)有死亡,但嚴(yán)重影響增重和降低飼料報(bào)酬,由此造成了藥物和人力增加等重大損失,是危害豬場(chǎng)最嚴(yán)重的疾病之一[2-3]。二者均為高度接觸性腸道疾病,分別由豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒引起。由于TGEV和PEDV有相似的臨床表現(xiàn)及傳染途徑,其鑒別診斷通常需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù),如病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)、PCR技術(shù)等[4]。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)等費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不適于臨床快速診斷,也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查;而PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、可進(jìn)行活體診斷等特點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)室診斷中具有較突出的優(yōu)勢(shì)[5]。因此本研究通過(guò)對(duì)豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的雙重RT-PCR檢測(cè)的建立和優(yōu)化為這兩種病毒的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒,均于西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物疾病快速診斷中心保存。

1.1.2 主要試劑 Total RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、Permix TaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNA Marker,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的基因序列,應(yīng)用Primer5.0分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物,序列見(jiàn)表1,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取 分別從實(shí)驗(yàn)室保存的流行性腹瀉、傳染性腹瀉毒株樣本中提取RNA,具體操作參見(jiàn)RNA試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)方法。

1.2.2 雙重RT-PCR方法的建立

1.2.2.1 RT反應(yīng) 取PEDV和TGEV樣本各3 μL,反轉(zhuǎn)錄酶混合液(PrimeScript RT Master Mix)2 μL,無(wú)RNA酶的超純水(RNase Free dH2O)補(bǔ)足至10 μL?；靹蚝笠?7℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃保存為反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到病毒 cDNA,置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 雙重RT-PCR反應(yīng)最佳退火溫度 取PEDV、TGEVcDNA 各 3 μL 為模版,Permix Taq TaqDNA 聚合酶 25 μL,上、下游引物各 1 μL,最后用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。退火溫度在51.8℃ ～57.8 ℃ 區(qū)間設(shè)置 51.8、52.2、52.9、54.1、55.5、56.6、57.3、57.8℃八個(gè)溫度梯度進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2.3 雙重RT-PCR反應(yīng)引物濃度稀釋 將設(shè)計(jì)的PEDV和TGEV引物用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行OD260nm/OD280nm值測(cè)定,將引物作10倍稀釋,并分別測(cè)定稀釋后的濃度,各取1 μl加入到多重PCR最佳退火溫度反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2.4 雙重RT-PCR反應(yīng)靈敏性檢測(cè) 將提取的PEDV和TGEV的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行OD260nm/OD280nm值測(cè)定,將模版作10倍系列稀釋,并分別測(cè)定稀釋后的含量,并各取1 μL加入到最佳反應(yīng)程序,進(jìn)行靈敏性檢測(cè)。

1.2.2.5 雙重RT-PCR反應(yīng)特異性檢測(cè) 分別取CSFV、PCV2、PRRSV和 PRV的 DNA或 RNA按照相同條件代替PDEV和TGEV的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,以檢測(cè)其特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重RT-PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化 以PEDV和TGEV基因組cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)電泳、測(cè)序分別得到462 bp和590 bp的cDNA序列,見(jiàn)圖1。

通過(guò)優(yōu)化確定最佳反應(yīng)體系(50 μL)為：25 μL 5X PeimeScript RT Master Mix酶,上、下游引物各1 μL,cDNA 模版 6 μL,ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。 對(duì)RT-PCR反應(yīng)溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,最后確定PEDV和TGEV的最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性50 s、52.9 ℃退火 1 min、72 ℃延伸1 min、循環(huán) 35次、72℃終末 10 min、15℃保存。

圖1 PEDV和TGEV雙重RT-PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化

2.2 雙重RT-PCR引物濃度稀釋 將PEDV和TGEV引物由原濃度10 μmol/L稀釋為1 μmol/L,5×10-1μmol/L,2.5 ×10-1μmol/L,1.25 ×10-1μmol/L,1×10-1μmol/L,1×10-2μmol/L,用雙重PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,電泳,結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)圖像對(duì)比可看出,引物濃度為5×10-1μmol/L時(shí),條帶最亮,其為最適引物濃度。

圖2 PEDV和TGEV雙重RT-PCR引物濃度稀釋

2.3 雙重RT-PCR靈敏性檢測(cè) 將cDNA濃度由原濃度93.3×101ng/μL以10倍梯度稀釋為93.3×100ng/μL,93.3 × 10-1ng/μL,93.3 × 10-2ng/μL,93.3×10-3ng/μL。用雙重PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增,跑電泳,結(jié)果見(jiàn)圖3。

通過(guò)圖像對(duì)比可以看出,cDNA濃度為93.3×101ng/μL時(shí),條帶最亮,故其為最適cDNA濃度。

圖3 PDEV和TGEV雙重RT-PCR的敏感性

2.4 雙重RT-PCR的特異性 用建立的雙重RTPCR方法檢測(cè)豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)均未出現(xiàn)條帶,顯示陰性,可見(jiàn)其特異性好。結(jié)果見(jiàn)圖4.

3 討論

圖4 雙重RT-PCR特異性檢測(cè)

2010年以來(lái),中國(guó)大陸大部分地區(qū)的豬場(chǎng)出現(xiàn)了仔豬腹瀉的疫情,與此同時(shí)韓國(guó)、日本、越南等亞洲國(guó)家及區(qū)域也發(fā)生腹瀉疫情,導(dǎo)致大量出生仔豬死亡。2013年4月以后,美國(guó)、加拿大、墨西哥等美洲國(guó)家,甚至有歐洲國(guó)家均有豬腹瀉疫情的報(bào)道,豬腹瀉病給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,其發(fā)病范圍的擴(kuò)大,再度引起了科研工作者們對(duì)引發(fā)腹瀉病相關(guān)病毒的研究熱情[6]。TGEV和PDEV這兩種病毒性腹瀉病是仔豬的常見(jiàn)疾病,發(fā)病率高,目前均無(wú)有效的藥物去預(yù)防和治療,且兩者在臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)上無(wú)明顯差異[7].傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,如細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)等雖能對(duì)兩者鑒別診斷,但它們最大的缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度低、周期長(zhǎng)[8]。RT-PCR技術(shù)是目前鑒別診斷TGEV和PEDV兩種病毒的特異性更強(qiáng)、敏感度更高的方法[9]。相對(duì)于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)單一病原體,雙重RTPCR能同時(shí)進(jìn)行多種病原微生物的鑒定,且具有靈敏、快捷等優(yōu)點(diǎn),適于大規(guī)模檢測(cè),在動(dòng)物疫病的流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)防中,具有不可替代的作用。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,某些新的檢測(cè)方法,如多重RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、恒溫隔熱RTPCR等也逐漸應(yīng)用于動(dòng)物病原的檢測(cè)[10],在臨床應(yīng)用中,也越來(lái)越多的運(yùn)用多重PCR技術(shù)解決疾病的診斷問(wèn)題,用以提高檢測(cè)的效率。多重PCR技術(shù)能在同一個(gè)體系中實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目的基因的特異性擴(kuò)增,相比普通單重PCR檢測(cè)效率更高、且節(jié)約試劑和人工成本,而較之熒光定量PCR、恒溫隔熱RT-PCR技術(shù),其靈敏度略低,但對(duì)儀器設(shè)備的要求、各項(xiàng)試劑耗材等成本也較低[11]。因此,雙重RT-PCR方法的建立對(duì)PEDV和TGEV的快速診斷有重要意義。

本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的PEDV和TGEV毒株設(shè)計(jì)特異性引物,建立了PEDV和TGEV雙重RT-PCR快速檢測(cè)方法。雙重RT-PCR檢測(cè)靈敏性顯示,該方法最低,cDNA模板檢出濃度為93.3×10-1ng/μL,表明本試驗(yàn)建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高,具有較高的檢測(cè)靈敏性。同時(shí),該雙重RT-PCR特異性結(jié)果顯示,該方法僅能檢測(cè)到PEDV和TGEV,不能檢測(cè)到PRRSV、CSFV和PRV等,對(duì)PEDV和TGEV的快速診斷和疫病防控具有重要意義。