李生慶,張西云,黃 榮,劉懷新,河生德,祁 果,胡國元,王亭亭,李積良

(1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院,青海 西寧 810016;2.青海省海晏縣獸醫(yī)站,青海 海晏 810018;3.青海省祁連縣野牛溝鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,青海 祁連 810400)

2017年7月,青海省海北州海晏縣青海湖鄉(xiāng)德吉村牧民養(yǎng)殖的羊發(fā)生急性死亡,臨床癥狀表現(xiàn)為病羊出現(xiàn)腹脹嚴重,并在2 h內(nèi)死亡 ,其他無明顯特征。剖檢心、肝、脾、腎、肺無明顯病理變化,小腸出血明顯,部分腸段呈血紅色,回盲口、盲腸大面積出血。截止送檢,已死亡羊17只,造成較大經(jīng)濟損失。根據(jù)臨床癥狀,該地區(qū)疫病發(fā)生流行病學狀況,初步懷疑此次疫病由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起。

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),是引起畜禽猝死癥、壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽的主要致病菌[1]。 該菌分 A、B、C、D、E 5個不同的菌型[2],致病性主要與其毒素有關(guān),其產(chǎn)生的毒素共有12種。其中α毒素是由一種5個菌型均產(chǎn)生的壞死、致死性毒素,有人認為其是 家畜“猝死癥”的主要致病因子[3-4]。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羊猝死癥,主要發(fā)生于羊的毒血癥,包括羊猝狙、羊腸毒血癥、羔羊痢疾等。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌為土壤常在菌,病原菌隨飼料和飲水被羊食入,可長期存在于腸道中,當消化道機能受到損壞時,病原菌迅速繁殖并產(chǎn)生大量毒素,從而使羊發(fā)病死亡,因此,很難在胃腸道之外的其他臟器內(nèi)分離到病原菌,這給該病的診斷工作增加了難度。

鑒于此,我們根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)毒素不同,設(shè)計具有特異性的擴增引物,進行了PCR診斷,并結(jié)合實驗室常規(guī)診斷,確定此次疫病是由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羊瘁疽。此次診斷中,利用產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)的α、β、ε三種主要毒素,建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR方法,可在很大程度上降低診斷的難度,并可節(jié)省時間,提高疫病診斷的精確性。

1 材料

1.1 病料來源：2017年7月,由青海省海北州海晏縣青海湖達玉鄉(xiāng)德吉村牧民送檢的病死羊心、肝、脾、腎、肺臟及部分腸段。

1.2 標準菌株：C型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株(721株),購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物室,腐敗梭菌(FB2010株)、B型諾維氏梭菌(TB05株)、D型肉毒梭菌 (D8901株)、B、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(烏B1株、C602株)菌株均為本實驗室分離保存菌株。

1.3 培養(yǎng)基的制備：血液瓊脂、厭氣肝湯兩種培養(yǎng)基均按常規(guī)制備,121℃滅菌40 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑：TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP(10 Mmol/L)、25 mmol/L的MgCl,均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司;瓊脂糖為Biowest產(chǎn)品;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 試驗動物：18～22 g昆明系小鼠,購自青海省地方病研究所。

2 方法

2.1 病原分離

2.1.1 組織摸片、鏡檢：將送檢羊心、肝、脾、腎、肺臟等臟器觸片,革蘭染色,鏡檢。

2.1.2 臟器培養(yǎng)：將送檢羊心、肝、脾、腎、肺臟等臟器接種于普通瓊脂斜面、普通肉湯、厭氣肝湯等培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h。

2.1.3 腸內(nèi)容培養(yǎng)：取病死羊腸道逐段抹片鏡檢,接種疑似菌密度較大腸段的內(nèi)容物于加有新鮮生肝塊的厭氣肝湯37℃培養(yǎng)24 h,將該培養(yǎng)物接種于鮮血瓊脂平板上,挑取疑似菌落,得到純培養(yǎng)物;也可直接用腸內(nèi)容物劃線接種于鮮血瓊脂平板,挑取疑似菌落。

2.2 動物試驗

2.2.1 腸內(nèi)容物毒素測定 將病死羊的回腸內(nèi)容物1 mL加入9 mL生理鹽水中,充分混勻后5000 r/min離心30 min,吸取上清液,用生理鹽水作適當稀釋后,在可能的毒力范圍內(nèi)靜脈注射小鼠,每一滴度注射2只,0.2 mL/只,觀察記錄小鼠死亡情況,確定小鼠最小致死量。

2.2.2 分離菌株產(chǎn)毒測定 血平板上培養(yǎng)24～48 h后,挑取平板上溶血特征明顯的單個菌落于VF厭氣肝湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,吸取純培養(yǎng)2 mL 2管,其中1管4 000 r/min離心30 min,另1管中加入2 mL含2.5 g/L胰酶的10 g/L的碳酸鈉溶液2 mL,37℃活化50 min后,用生理鹽水倍比稀釋,每一滴度靜脈注射小鼠2只,0.2 mL/只,觀察記錄小鼠發(fā)病、死亡情況,確定小鼠最小致死量。

2.3 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重PCR檢測

2.3.1 DNA模板的制備 將純化的分離待檢菌和標準陽性產(chǎn)氣莢膜梭菌分別接種于鮮血平板,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,挑取單個菌落3～4個至裝有0.5 mL蒸餾水的Doff管中,震蕩混勻,12 000 r/min離心1 min,棄去上清液,用1×PBS緩沖液200 μL懸浮菌體,13000 r/min離心1 min,棄上清后加入200 μL 1×PBS液重懸,混勻后加入蛋白酶K 20 μL,再加200 μL CB結(jié)合液,混勻后,70℃水浴放置10 min.取出冷卻后加100 μL異丙醇,混勻。利用博邁德科技發(fā)展有限公司研制的組織/細胞DNA提取試劑盒提取DNA.提取物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中報道的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因序列及相關(guān)的參考文獻[1～4],分別在α毒素和ε毒素的保守區(qū)域設(shè)計2對引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如下：

α 毒素：上游引物：5′-CACGATGTATCAGAGGGTA-3′;

下游引物：5′-TAAGTGTCTTTGCTTCCAG-3′;

預期擴增片段大小：325 bp;

β 毒素：上游引物：5′-GCGAATATGCTGAATCATCTA-3′;

下游引物：5′-GCAGGAACATTTAGTATATCTTC-3′;

預期擴增片段大?。?36 bp;

ε 毒素：上游引物：5′-GTATCTAATGAAATGTCCA-3′;

下游引物：5′-CTTCCACTTACTTGTCCTAC-3′;預期擴增片段大?。?85 bp。

2.3.3 PCR擴增反應體系 PCR反應總體系為25 μL：10 × Buffer緩沖液 2.5 μL,10 mmol/LdNTP 1.0 μL,上下游引物各 0.5 μL,模板 DNA 5.0 μL,Taq DNA 聚合酶 0.5 μL,滅菌雙蒸水 14 μL。

反應程序為：96℃預變性20 min,然后94℃變性30 s,51℃延伸40 s,72℃復性1 min,共循環(huán)30次,最后在72℃延伸10 min。

2.3.4 PCR產(chǎn)物電泳 PCR反應結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳120 V,20 min,紫外燈下觀察并拍照,分析PCR擴增結(jié)果。

2.3.5 PCR檢測的特異性試驗 分別以C型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株(721株)為陽性對照,以乳酸大腸桿菌、D型肉毒梭菌、腐敗梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、B型諾維氏梭菌等作為陰性對照,檢測PCR反應的特異性。

3 結(jié)果

3.1 組織觸片鏡檢 送檢各臟器觸片,革蘭染色后鏡檢,均未未見到有疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌存在,不同腸段摸片,革蘭染色鏡檢,可見有革蘭陽性、兩端鈍圓的大桿菌。

3.2 分離菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性 小腸內(nèi)容物在厭氣肝湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后涂片,見到兩端鈍圓的大桿菌;在鮮血瓊脂平板上厭氣培養(yǎng)24 h開始生長,48 h可見圓形略隆起、灰白色半透明的菌落,菌落周圍有溶血環(huán),涂片鏡檢可見與腸內(nèi)容物涂片相同的細菌(見圖1,2)。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 平板溶血特性

3.3 動物試驗結(jié)果 分別從4個腸段血平板培養(yǎng)基上挑取菌落形態(tài)大小、溶血不一的菌落,接種于VF厭氣肝湯中,37℃培養(yǎng)24 h,經(jīng)胰酶活化和未活化培養(yǎng)物離心后,上清經(jīng)稀釋后測毒,經(jīng)胰酶活化后,所有菌株培養(yǎng)物均未致死小鼠,未活化菌株培養(yǎng)物測得其小鼠最小致死量分別為50～1 000 MLD/mL(見圖3)。

圖3 不同菌株產(chǎn)毒能力對比

3.4 PCR擴增結(jié)果 利用合成的2種引物進行PCR擴增,標準菌株C602和分離菌株都擴增出大小為325 bp的α毒素及236 bp的β毒素的目的條帶,結(jié)果如圖4。

圖4 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株P(guān)CR擴增

3.5 特異性試驗 在相同條件下,只有標準菌株和兩株分離菌擴增出大小325 bp的α毒素及585 bp的ε毒素相應條帶,其他腐敗梭菌、乳酸大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均未擴增出上述條帶,表明該試驗結(jié)果具有很好的特異性。結(jié)果如圖5。

圖5 特異性擴增結(jié)果

4 討論

4.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于土壤、污水、飼料、糞便以及動物腸道中。若飼養(yǎng)管理不當、氣候變化等諸多因素改變極易誘發(fā)綿羊和山羊發(fā)病,引起羊腸毒血癥、羊猝狙、羔羊痢疾等,導致發(fā)病動物急性死亡[5]。因此,經(jīng)?？床坏教卣靼Y狀即發(fā)生死亡,雖然可以初步懷疑是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疫病,但若要得到確切的結(jié)果,就必須分離到菌株,且進行血清型鑒別,才能確診。由于該菌是由腸道毒素引起的動物急性死亡,故在臟器內(nèi)一般分不到病原菌,而從腸道內(nèi)分離致病菌株尤其麻煩。另外,只有得到確切的分型結(jié)果,才能指導牧戶正確使用疫苗進行全群預防,防治疫病的繼續(xù)發(fā)生。因此建立產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速診斷方法,對于疫病的診斷、檢測以及預防具有重大的意義。

4.2 此次病死羊的診斷過程中,我們從不同腸段分離到產(chǎn)毒能力不一的菌株11株,以往的試驗中,一般在同一腸段的培養(yǎng)基上挑取1～2個典型、單個菌落進行培養(yǎng),測毒分析,然而,此次試驗結(jié)果證明,同一腸段上的不同菌落在同一培養(yǎng)條件下的產(chǎn)毒能力有較大區(qū)別,此次試驗中,1號結(jié)腸段,共分離出5株菌,毒力最低的為100 MLD/mL,最高的達1 000 MLD/mL,回腸4號腸斷共分出3株菌,毒力最低的為50 MLD/mL,最高的達1 000 MLD/mL,2號結(jié)腸段共分離出3株菌,毒力在500-1 000 MLD/ml之間。因此,在進行病原菌毒力分析時,盡可能多挑菌落,才能選出致病性較高的菌株,作為疫苗生產(chǎn)的備用菌株。另外,如果挑選菌落太少,找不到致病性病原菌,就會對疫病的診斷結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

4.3 隨著分子生物學研究的發(fā)展,許多產(chǎn)氣莢膜梭菌新的定型方法相繼出現(xiàn),比如基因芯片和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[6]等。目前,國內(nèi)外利用PCR方法擴增產(chǎn)氣莢膜梭菌不同毒素完成病原檢測的比較多[7]。早期常經(jīng)過單獨擴增每個主要致死毒素基因(4～5次)才能完成病原分離株的定型[8]。多重PCR具有很高的敏感度和特異性,從而實現(xiàn)高效率、短周期、低成本的檢測目的[9]。本試驗依據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌不同血清型產(chǎn)毒素種類的差異,利用多重PCR方法,對分離株進行鑒別診斷,得到的結(jié)果與實驗室診斷結(jié)果相一致,證明該方法對于建立產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速診斷方法具有指導意義。