王麗麗 崔 娜 趙志明 王 瑋 張樹成 王 寧 石翠格 郝桂敏*

1．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院( 石家莊，050000) 2．國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所

多囊卵巢綜合征( PCOS) 是育齡女性常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，發(fā)生率5%～10%［1］。PCOS 患者妊娠易出現(xiàn)一些臨床妊娠并發(fā)癥［2］。一些研究證明PCOS 患者的子宮內(nèi)膜功能和表型存在異常［3］。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)( ECS) 可參與調(diào)控能量代謝、控制胰島素分泌、維持血脂水平及性激素等，內(nèi)源性大麻素受體1( CB1) 可表達(dá)于子宮及輸卵管、卵巢的皮質(zhì)和髓質(zhì)［4-5］。內(nèi)源性大麻素花生四烯酸乙醇胺( AEA) 信號(hào)通路參與胚胎發(fā)育和改善子宮內(nèi)膜容受性，使種植前胚胎與子宮內(nèi)膜種植窗期保持同步化［6］。ECS 信號(hào)過高或過低都會(huì)損害胎盤植入和分娩過程［7-8］。PCOS 女性代謝紊亂影響子宮內(nèi)膜，可能增加妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)后代造成影響［9］。本研究通過建立PCOS 大鼠模型，研究ECS 信號(hào)在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)變化，探究PCOS 患者子宮內(nèi)膜蛻膜化調(diào)控機(jī)制，為臨床診治提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～5 周齡SD 大鼠30 只( 河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室購買，動(dòng)物室溫度21 ～22℃，濕度55%～65%，12 h/12h 光照黑暗周期) ，每籠3 ～5 只。動(dòng)物可自由攝水?dāng)z食。

1．2 主要試劑及配制

來曲唑( 美國sigma) ;羧甲基纖維素( 北京索萊寶有限公司) ; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒( 日本Takara) 。1%羧甲基纖維素: 1g 羧甲基纖維素溶于100ml dd H2O 中。

1．3 PCOS 動(dòng)物模型建立

將SD 大鼠隨機(jī)分為3 組，每組7 只。①PCOS組:每天給予大鼠來曲唑( 1mg/kg 劑量) 灌胃，給藥21 天，建立PCOS 大鼠模型; ②對(duì)照組: 給予同等體積的1%的羧甲基纖維素，連續(xù)定時(shí)灌服21 天;③空白組:不作任何處理。

1．4 標(biāo)本數(shù)據(jù)采集與處理

每日對(duì)各組大鼠進(jìn)行陰道涂片并HE 染色，判斷動(dòng)情周期變化。每3 日對(duì)各組大鼠稱重并記錄。給藥21 天后，稱重，用3%的戊巴比妥鈉麻醉，用摘除眼球法取血，離心取血清，-20℃保存?zhèn)溆?。取出雙側(cè)卵巢子宮分別稱重后，一側(cè)卵巢和子宮置于4%的多聚甲醛中固定，另一側(cè)卵巢和子宮分別于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

①目的基因引物的合成: 引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。引物序列見表1。提取大鼠子宮內(nèi)膜組織總RNA 并檢測(cè)其質(zhì)量，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 采用CFX96 序列檢測(cè)系統(tǒng)。在含有10μl TB Green Premix Ex Taq II、6μl ddH2O、2μl cDNA 以及上、下游各0．8μl 的20μl 總反應(yīng)體系中，進(jìn)行如下擴(kuò) 增:95 ℃預(yù)變性30s;95℃5s，60℃30s 共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。待測(cè)樣品分別以內(nèi)參基因( β?actin) 作為參照，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，以3 次得到的Ct 值的平均值為最終測(cè)定結(jié)果。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究所得數(shù)據(jù)均利用SPSS 20．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差( 珋x±s) 表示，行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0．05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2．1 PCOS 大鼠模型的建立

隨著給藥時(shí)間的延長，PCOS 組雌鼠的平均體重逐漸高于對(duì)照組，兩周后高于對(duì)照組( P＜0．05) ;3周后PCOS 組子宮重量比對(duì)照組明顯降低，卵巢重量明顯升高( 均P＜0．05) 。見圖1。

圖1 PCOS 組和對(duì)照組體重、子宮和卵巢重量比較

2．2 動(dòng)情周期

陰道涂片HE 染色結(jié)果觀察動(dòng)情周期顯示，對(duì)照組動(dòng)情周期規(guī)律，一般4～5 天。PCOS 組在給予來曲唑前兩周動(dòng)情周期規(guī)律，用藥第12 天后大部分雌鼠無規(guī)律的動(dòng)情周期，基本處于動(dòng)情間期。見圖2。

2．3 子宮、卵巢大體形態(tài)學(xué)觀察

與對(duì)照組相比，PCOS 組子宮較細(xì)，卵巢體積較大。見圖3、圖4。

2．4 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)分子在大鼠子宮中的表達(dá)

Real-time PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PCOS組內(nèi)源性大麻素受體CB1 和內(nèi)源性大麻素合成酶NAPEPLD 的表達(dá)量明顯升高，水解酶FAAH 表達(dá)量明顯降低( 均P＜0．05) ; 內(nèi)源性大麻素受體CB2表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P＞0．05) 。見圖4。

圖2 對(duì)照組(A)和PCOS 組(B)老年期動(dòng)情周期變化

圖3 大鼠子宮大體形態(tài)圖

圖4 大鼠子宮內(nèi)膜中內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)相關(guān)分子和NAPEPLD 的mRNA 表達(dá)量比較

3 討論

育齡期PCOS 患者生育能力下降甚至不孕，主要表現(xiàn):不孕，自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加，妊娠期并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加。妊娠早期自發(fā)流產(chǎn)可能與滋養(yǎng)層入侵和胎盤形成異常有關(guān)［10-12］，導(dǎo)致滋養(yǎng)層入侵和胎盤異常的原因之一可能與子宮內(nèi)膜蛻膜化異常。子宮內(nèi)膜蛻膜化異?？赡苁荘COS 患者后續(xù)妊娠并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。因此，研究內(nèi)源性大麻素在PCOS 子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，對(duì)進(jìn)一步了解PCOS 患者妊娠并發(fā)癥發(fā)病機(jī)理具有重要意義。

PCOS 患者多表現(xiàn)為排卵和胚胎著床及受孕障礙。目前尚無有效治療方法。由于人群中病例材料獲取十分困難，因此合適的動(dòng)物模型對(duì)研究PCOS致病機(jī)理和診療策略極為必要。本研究選用SD 大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［13］，采用來曲唑建立PCOS 大鼠模型，灌胃給予來曲唑21 天后，PCOS 組體重明顯高于對(duì)照組，動(dòng)情周期發(fā)生紊亂，卵巢重量明顯升高，子宮重量明顯下降，與文獻(xiàn)報(bào)道的PCOS 大鼠模型一致。說明本次研究成功建立了大鼠PCOS 模型。文獻(xiàn)報(bào)道，來曲唑誘導(dǎo)PCOS 大鼠模型血清雌激素水平降低［14］。在卵巢去勢(shì)的大鼠模型中，給予雌激素和孕酮后，子宮上皮和基層中FAAH 水平明顯升高［15］。但在卵巢去勢(shì)的大鼠模型中，單獨(dú)給予雌激素后，子宮上皮和腺體中CB1、CB2、NAPE-PLD、FAAH 表達(dá)均明顯升高［16］。說明在來曲唑誘導(dǎo)PCOS 大鼠模型中，可能是雌激素和孕激素共同參與調(diào)節(jié)其體內(nèi)ECS 的表達(dá)。

Real-time PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠子宮內(nèi)膜CB1 和NAPEPLD mRNA 表達(dá)量明顯升高，F(xiàn)AAH mRNA 表達(dá)量明顯降低。說明在PCOS 大鼠子宮內(nèi)膜中內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)分子CB1、NAPEPLD 和FAAH 表達(dá)發(fā)生改變。說明子宮中ECS 的變化可能對(duì)后續(xù)妊娠蛻膜化產(chǎn)生重要影響。有研究表明小鼠子宮AEA 水平下降會(huì)增加子宮內(nèi)膜容受性［17］。Fonseca 研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠蛻膜化發(fā)育的階段中，高水平NAPE-PLD 提高了AEA 水平，從而參與蛻膜重塑過程，待蛻膜化形成后FAAH 水平發(fā)生高表達(dá)，證實(shí)了AEA 代謝酶在早期妊娠信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［18-19］。

綜上，本研究建立的PCOS 大鼠模型子宮中ECS 異常，該結(jié)果也為今后利用此模型研究ECS 與PCOS 致病機(jī)理，以及與妊娠結(jié)局關(guān)系提供基礎(chǔ)。